魯氏酵母(Z.rouxii)是豆醬和醬油釀造體系的優(yōu)勢菌,可以在發(fā)酵過程中把糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成有機(jī)酸、醇和其他風(fēng)味代謝產(chǎn)物并產(chǎn)生芳香族化合物。其中4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(HDMF)和4-羥基-2乙基-5甲基-3(2H)-呋喃酮(HEMF)作為魯氏酵母重要的香氣來源,也是醬油和豆醬當(dāng)中的主要香氣物質(zhì),但是其代謝機(jī)制尚不清楚。前期研究發(fā)現(xiàn),添加D-果糖可促進(jìn)魯氏酵母高產(chǎn)呋喃酮,因此明確外源D-果糖調(diào)控魯氏酵母合成HDMF和HEMF的碳代謝機(jī)制,有助于為魯氏酵母生物合成食品呈香化合物細(xì)胞工廠創(chuàng)制提供理論依據(jù)。本文通過研究魯氏酵母外源添加D-果糖對HDMF和HEMF生物合成過程中不同發(fā)酵時(shí)期的基因的表達(dá)量、酶調(diào)控作用及其代謝物變化,并利用HPLC對HDMF和HEMF進(jìn)行定量分析,應(yīng)用酶學(xué)方法在蛋白水平進(jìn)行共同論證,并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)從分子角度進(jìn)一步揭示其代謝機(jī)制,為呋喃酮的生物合成提供了新的理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:(1)利用Illumina HiSeqTM高通量測序平臺對外源添加D-果糖的魯氏酵母進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,分別獲得了不同發(fā)酵時(shí)期的Clean reads,采用HTSe...

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 魯氏酵母
        1.1.1 魯氏酵母的簡介
        1.1.2 魯氏酵母的研究現(xiàn)狀
    1.2 呋喃酮的理化性質(zhì)
        1.2.1 呋喃酮簡介
        1.2.2 呋喃酮的研究現(xiàn)狀
    1.3 魯氏酵母的碳代謝研究
        1.3.1 魯氏酵母胞內(nèi)EMP碳代謝途徑合成HDMF
        1.3.2 魯氏酵母胞內(nèi)PP途徑合成HEMF
    1.4 pH值對魯氏酵母的影響
    1.5 微生物多組學(xué)技術(shù)
        1.5.1 微生物轉(zhuǎn)錄組學(xué)
        1.5.2 微生物代謝組學(xué)
    1.6 本文的研究目的與主要內(nèi)容
        1.6.1 研究目的與意義
        1.6.2 項(xiàng)目的研究內(nèi)容
        1.6.3 技術(shù)路線
2 材料與方法
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 菌種、培養(yǎng)基和引物
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 儀器和設(shè)備
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 魯氏酵母的培養(yǎng)與活化
        2.2.2 酵母菌活菌數(shù)測定方法及細(xì)胞干重含量測定
        2.2.3 細(xì)胞光密度與pH值測定
        2.2.4 魯氏酵母轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建及測序
        2.2.5 基于RNA-Seq技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
        2.2.6 總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄以及驗(yàn)證
        2.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證分析
        2.2.8 呋喃酮合成關(guān)鍵酶的測定
        2.2.9 LC-MS/MS分析
        2.2.10 魯氏酵母呋喃酮檢測
        2.2.11 生物信息學(xué)分析
    2.3 數(shù)據(jù)處理
3 結(jié)果與分析
    3.1 D-果糖對魯氏酵母細(xì)胞生長的影響
        3.1.1 添加D-果糖對魯氏酵母生物量的影響
        3.1.2 添加D-果糖對魯氏酵母細(xì)胞菌數(shù)以及OD值的影響
        3.1.3 添加D-果糖對魯氏酵母菌落生長情況的影響
    3.2 呋喃酮高效液相色譜檢測優(yōu)化
        3.2.1 HDMF檢測波長的選擇
        3.2.2 色譜柱的選擇
        3.2.3 進(jìn)樣量的選擇
        3.2.4 洗脫條件的優(yōu)化
        3.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
    3.3 添加D-果糖對HDMF和 HEMF產(chǎn)量的影響
    3.4 pH值對魯氏酵母生長情況及產(chǎn)呋喃酮的影響
        3.4.1 添加D-果糖對魯氏酵母發(fā)酵液pH值的影響
        3.4.2 pH值對魯氏酵母OD值的影響
        3.4.3 pH值對魯氏酵母產(chǎn)HDMF的影響
    3.5 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
        3.5.1 轉(zhuǎn)錄組測序及初步分析
        3.5.2 差異表達(dá)基因分析
        3.5.3 GO富集分析
        3.5.4 KEGG pathway富集分析
        3.5.5 KEGG途徑的DEGs分析
    3.6 RNA樣品的制備、處理以及引物驗(yàn)證
        3.6.1 魯氏酵母RNA提取
        3.6.2 魯氏酵母反轉(zhuǎn)錄c DNA模板PCR驗(yàn)證
        3.6.3 魯氏酵母碳代謝差異基因溶解曲線
    3.7 呋喃酮合成相關(guān)的基因的相對表達(dá)情況
        3.7.1 呋喃酮合成相關(guān)基因在EMP和 PP途徑中的瞬時(shí)過表達(dá)
        3.7.2 TCA循環(huán)中差異基因的瞬時(shí)表達(dá)
    3.8 EMP和 PP途徑關(guān)鍵酶活測定
    3.9 魯氏酵母代謝產(chǎn)物對比分析
        3.9.1 OPLS-DA分析
        3.9.2 EMP和 PP途徑中與呋喃酮合成相關(guān)的代謝物
        3.9.3 魯氏酵母揮發(fā)性代謝產(chǎn)物分析
    3.10 魯氏酵母FBA基因生物信息學(xué)分析
        3.10.1 FBA基因的理化性質(zhì)分析
        3.10.2 FBA的 CpG島分析
        3.10.3 FBA的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測
4 討論
    4.1 外源添加D-果糖對魯氏酵母生長特性的影響
    4.2 pH值對魯氏酵母產(chǎn)呋喃酮的影響
    4.3 外源添加D-果糖對魯氏酵母碳代謝的影響
    4.4 FBA基因的生物信息學(xué)分析
5 結(jié)論
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
個(gè)人簡歷



本文編號：4048897