MarR家族是一種廣泛存在于古菌和細(xì)菌中古老而重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,在應(yīng)激條件下負(fù)責(zé)基因表達的調(diào)控。SlyA蛋白是屬于MarR家族的轉(zhuǎn)錄因子,在多種致病菌中調(diào)控菌體在宿主內(nèi)的生存能力和毒力因子的表達。而熒光假單胞菌屬于重要的生防菌,其SlyA蛋白的調(diào)節(jié)機制和功能卻鮮有報道。本文的研究以調(diào)節(jié)外排泵EmhABC的轉(zhuǎn)錄因子EmhR和SlyA存在共適應(yīng)性為切入點,探究了熒光假單胞菌2P24中SlyA的調(diào)控機制和功能。我們發(fā)現(xiàn)SlyA可以調(diào)節(jié)EmhABC基因的表達,熒光假單胞菌2P24的slyA敲除株對部分抗生素的抗性降低了。而且SlyA是負(fù)調(diào)控自身基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。SlyA以結(jié)合在被其調(diào)控基因的啟動子的方式激活或抑制被調(diào)控基因的表達,其特異性識別結(jié)合的DNA序列通式為偽回文序列TTA-N₆-TAA。本文也尋找了熒光假單胞菌2P24基因組中啟動子區(qū)含有TTA-N₆-TAA的基因,作為SlyA調(diào)控的候選基因。質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析顯示slyA基因敲除株與phoP基因敲除株蛋白表達差異存在較高的平行性,在表型上均展示出生物膜形成能力的加強,slyA敲除株生物膜形成...

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【學(xué)位級別】：碩士

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中文摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 根際促生菌與熒光假單胞菌
    1.2 MarR蛋白家族簡介
    1.3 marORAB操縱子的結(jié)構(gòu)
    1.4 MarR家族蛋白的的結(jié)構(gòu)
    1.5 MarR家族蛋白的功能
        1.5.1 抵抗環(huán)境壓力
        1.5.2 抗生素應(yīng)答
        1.5.3 金屬離子應(yīng)答
        1.5.4 調(diào)節(jié)細(xì)菌毒力的表達
    1.6 MarR家族的SlyA蛋白
        1.6.1 SlyA蛋白的功能
        1.6.2 SlyA蛋白的結(jié)構(gòu)與DNA結(jié)合動力學(xué)。
        1.6.3 SlyA蛋白與PhoQ-PhoP雙組分系統(tǒng)的關(guān)聯(lián)
        1.6.4 SlyA既有轉(zhuǎn)錄抑制作用,又有轉(zhuǎn)錄激活作用
    1.7 本文立意
第二章 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 試劑與儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 基因缺失菌株的構(gòu)建
        2.2.2 SlyA蛋白表達載體構(gòu)建
        2.2.3 SlyA蛋白質(zhì)的表達
        2.2.4 SlyA蛋白質(zhì)的純化
        2.2.5 凝膠阻滯實驗(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)
        2.2.6 DNase I足跡法實驗
        2.2.7 細(xì)菌全RNA的提取、c DNA的制備和熒光定量PCR實驗
        2.2.8 β-半乳糖苷酶報告載體的構(gòu)建及β-半乳糖苷酶酶活的測定
        2.2.9 菌體總蛋白質(zhì)組學(xué)制樣、上樣及蛋白質(zhì)組學(xué)分析
        2.2.10 細(xì)菌的抗生素最小抑制濃度(MIC)檢測
        2.2.11 細(xì)菌運動能力的檢測
        2.2.12 細(xì)菌生物膜形成能力的檢測
第三章 實驗結(jié)果與分析
    3.1 轉(zhuǎn)錄因子SlyA與轉(zhuǎn)錄因子EmhR存在共適應(yīng)性
        3.1.1 共適應(yīng)性分析
        3.1.2 熒光假單胞菌2P24中序列分析
    3.2 熒光假單胞菌2P24菌株slyA基因的編碼框內(nèi)敲除
    3.3 熒光假單胞菌2P24 菌株SlyA蛋白涉嫌調(diào)控emhABC基因
        3.3.1 熒光假單胞菌2P24中slyA基因的敲除株負(fù)面影響該菌的多重耐藥性
        3.3.2 SlyA蛋白對emhABC基因的表達調(diào)控的探究
    3.4 SlyA蛋白識別的DNA序列通式為TTA-N6-TAA
        3.4.1 DNase I足跡法尋找SlyA蛋白與DNA鏈結(jié)合的位置
        3.4.2 凝膠阻滯實驗(EMSA)證明SlyA蛋白的結(jié)合序列為TTA-N6-TAA
    3.5 熒光假單胞菌2P24與大腸桿菌、鼠沙門氏菌SlyA蛋白序列有一定同源性
    3.6 SlyA蛋白自我調(diào)控slyA基因的表達
    3.7 被SlyA蛋白調(diào)控的下游基因的尋找
    3.8 SlyA蛋白與雙組分系統(tǒng)PhoQ-PhoP功能關(guān)系的質(zhì)譜分析
    3.9 slyA基因敲除株與phoP基因敲除株的生物膜、泳動性檢測
        3.9.1 slyA敲除株與phoP敲除株生物膜形成能力的檢測
        3.9.2 slyA敲除株與phoP敲除株游泳能力、涌動能力檢測
    3.10 SlyA蛋白識別小分子配體尋找的嘗試
第四章 結(jié)論、討論與展望
    4.1 主要結(jié)論
    4.2 討論與展望
參考文獻
附錄
引物匯總
致謝



本文編號：4014407