小球藻繁殖迅速,易培養(yǎng),可作為生物反應(yīng)器的模式菌株;藻中含有的多種營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分,可以具有提高人體免疫力、具有抗氧化、抗腫瘤等功能。為了提高微藻生物質(zhì)生產(chǎn)的能力或者獲某些特異性能,基因突變或基因編輯是目前最為經(jīng)濟(jì)和迅速地研究方法,其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)因具有操作簡單,精確度高等優(yōu)勢,成為小球藻基因編輯體系中研究重點(diǎn)。目前通過電轉(zhuǎn)化將帶有特定基因工程選擇標(biāo)記的Cas9質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化到小球藻中尚未見報(bào)道。本論文將通過優(yōu)化電容、電壓、電阻等電轉(zhuǎn)化條件,探索帶有G418抗性的Cas9質(zhì)粒導(dǎo)入小球藻中的方法,以便建立微藻的電轉(zhuǎn)化體系。首先,利用BG11培養(yǎng)基,通過平板劃線法從河北的4條河流水域中篩選得到4株微藻。通過建立鏡檢并結(jié)合18S rDNA序列選擇其中的一株球藻作為實(shí)驗(yàn)藻株。測定了實(shí)驗(yàn)藻株680nm處的OD值并繪制生長曲線,觀察其對(duì)不同濃度的G418、氨芐氯霉素、卡那霉素和潮霉素的敏感性,確立了G418可以作為為小球藻基因工程篩選標(biāo)記。其次選取了含NEO啟動(dòng)子(含有G418抗性)基因的植物雙元表達(dá)載體pBI121質(zhì)粒,針對(duì)該質(zhì)粒的NEO啟動(dòng)子基因序列設(shè)計(jì)了帶有HindIII酶切位點(diǎn)...

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
1 引言
    1.1 微藻概述
        1.1.1 微藻的概念和分類
        1.1.2 小球藻的結(jié)構(gòu)及生長特性
        1.1.3 小球藻的用途
    1.2 CRISPR/Cas9 技術(shù)的研究進(jìn)展
    1.3 電轉(zhuǎn)化技術(shù)的應(yīng)用
    1.4 項(xiàng)目的研究意義
    1.5 本項(xiàng)目的研究方法及技術(shù)路線
2 小球藻的篩選及抗生素選擇標(biāo)記的確定
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 水樣來源
        2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 培養(yǎng)基制備
        2.2.2 藻株篩選
        2.2.3 微藻基因組的提取
        2.2.4 18SrDNA的擴(kuò)增及測序
        2.2.5 進(jìn)化樹構(gòu)建
        2.2.6 標(biāo)記抗生素的配制和使用濃度
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 藻株篩選結(jié)果
        2.3.2 藻株鑒定結(jié)果
        2.3.3 BY藻株對(duì)抗生素敏感性
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
3 pRGE31 載體的重構(gòu)
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 質(zhì)粒、菌株及主要工具酶
        3.1.2 分析軟件及數(shù)據(jù)庫
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.1.4 培養(yǎng)基的配置
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 載體構(gòu)建
        3.2.2 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化
        3.2.3 產(chǎn)物與線性化pRGE31 連接
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 目標(biāo)基因的獲得結(jié)果
        3.3.2 pRGE31 經(jīng)酶切線性化結(jié)果
        3.3.3 重組質(zhì)粒的篩選結(jié)果
        3.3.4 重組質(zhì)粒鑒定
        3.3.5 重組質(zhì)粒測序結(jié)果
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
4 微藻電擊轉(zhuǎn)化條件探究
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 質(zhì)粒及菌株
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 藻種BY感受態(tài)細(xì)胞的制備
        4.2.2 藻種BY電轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化
        4.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化
        4.2.4 DNA的提取
        4.2.5 重組質(zhì)粒pRGE31 轉(zhuǎn)化子的篩選
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        4.3.1 藻種BY電轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化結(jié)果
        4.3.2 響應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        4.3.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化藻種BY
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
5 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
        5.1.1 小球藻的篩選及抗生素選擇標(biāo)記的確定
        5.1.2 pRGE31 載體的重構(gòu)
        5.1.3 小球藻電擊轉(zhuǎn)化條件探究
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄 A 實(shí)驗(yàn)儀器
    附錄 B 實(shí)驗(yàn)試劑
    附錄 C 文中涉及的測序序列
作者簡歷
致謝



本文編號(hào)：3779225