熱休克蛋白90(Heat shock protein 90,Hsp90)是一類單體分子量90kD左右的分子伴侶蛋白,廣泛存在于原核和真核生物中。該類蛋白高度保守,且在細胞中含量豐富,為細胞生存所必需,參與折疊及調(diào)控多種與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細胞周期調(diào)控相關(guān)的蛋白,在維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。因其顧客蛋白(Client proteins)多與細胞增殖及腫瘤進展相關(guān),Hsp90成為抗腫瘤藥物設(shè)計的關(guān)鍵靶點。Hsp90在真核細胞中有α和β兩個亞型,以α-α或β-β的二聚體形式發(fā)揮活性。其N端為ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域,具有ATP酶活性,可與抑制劑或輔分子伴侶結(jié)合;中間結(jié)構(gòu)域主要與顧客蛋白及輔分子伴侶結(jié)合;C端結(jié)構(gòu)域主要負責(zé)其二聚化。已有電鏡及晶體結(jié)構(gòu)解析表明,Hsp90功能的發(fā)揮通過其N端結(jié)合ATP驅(qū)動瞬時的二聚化及ATP水解后二聚化打開的這種由閉合到開放狀態(tài)的構(gòu)象變化完成。生活在海平面7000m以下的馬里亞納海溝的一種深海獅子魚(Pseudoliparis swirei)的基因組中,hsp90基因有五個拷貝,且其中四個拷貝均在N端結(jié)構(gòu)域的一保守位點發(fā)生了重復(fù)性固定突變。據(jù)同源建模結(jié)果分析,該突變位點緊鄰...

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【學(xué)位級別】：碩士

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中文摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 蛋白質(zhì)折疊
    1.2 分子伴侶協(xié)助蛋白質(zhì)折疊
    1.3 熱休克蛋白家族簡介
        1.3.1 smHSPs組成結(jié)構(gòu)與功能簡介
        1.3.2 HSP40s組成結(jié)構(gòu)與功能簡介
        1.3.3 HSP60s組成結(jié)構(gòu)與功能簡介
        1.3.4 HSP70s概述
            1.3.4.1 Hsp70結(jié)構(gòu)特征
            1.3.4.2 Hsp70功能簡介
            1.3.4.3 Hsp70輔助蛋白介紹
        1.3.5 HSP90s概述
            1.3.5.1 Hsp90結(jié)構(gòu)特征
            1.3.5.2 Hsp90功能介紹
            1.3.5.3 Hsp90與客戶蛋白和輔分子伴侶間的相互作用
            1.3.5.4 Hsp90 構(gòu)象循環(huán)具有ATP依賴性
        1.3.6 HSP100s組成結(jié)構(gòu)與功能簡介
    1.4 關(guān)于深海獅子魚(Hadal snailfish)Hsp90 研究現(xiàn)狀
    1.5 小結(jié)
第二章 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 基因、質(zhì)粒和菌株
        2.1.2 實驗試劑與耗材
        2.1.3 主要實驗儀器
        2.1.4 主要溶液配方
    2.2 蛋白表達系統(tǒng)的比較與選擇
        2.2.1 常見蛋白表達系統(tǒng)介紹
        2.2.2 蛋白表達系統(tǒng)的選擇
    2.3 蛋白表達載體的選擇
    2.4 RNA反轉(zhuǎn)錄與PCR擴增獲取目的基因
    2.5 構(gòu)建重組載體
        2.5.1 雙酶切目的基因和質(zhì)粒
        2.5.2 目的片段和質(zhì)粒進行連接
    2.6 克隆重組載體
        2.6.1 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞
        2.6.2 菌落PCR及測序驗證
        2.6.3 搖菌及小提質(zhì)粒
    2.7 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞并進行驗證
    2.8 目的蛋白的誘導(dǎo)表達
    2.9 蛋白純化
        2.9.1 蛋白純化常用方法介紹
        2.9.2 His-Tag融合蛋白Hsp90 的純化
        2.9.3 Strep-tagII融合蛋白Hsp90 的純化
    2.10 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析
    2.11 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)驗證目的蛋白的表達
    2.12 蛋白質(zhì)譜鑒定
    2.13 Hsp90 蛋白ATPase活性的測定
    2.14 電鏡觀察蛋白狀態(tài)并進行初步三維重構(gòu)
        2.14.1 負染色技術(shù)概述及原理
        2.14.2 負染制樣流程
        2.14.3 數(shù)據(jù)采集
        2.14.4 數(shù)據(jù)處理并做初步三維重構(gòu)
第三章 結(jié)果與分析
    3.1 hsp90基因重組載體構(gòu)建結(jié)果
        3.1.1 含His-tag序列的hsp90 基因重組載體構(gòu)建結(jié)果
        3.1.2 含Strep-tag II序列的hsp90 基因重組載體構(gòu)建結(jié)果
    3.2 His-tag融合蛋白Hsp90 表達純化結(jié)果
        3.2.1 WB驗證與質(zhì)譜鑒定Hsp90蛋白表達情況
            3.2.1.1 WB驗證結(jié)果
            3.2.1.2 質(zhì)譜鑒定結(jié)果
        3.2.2 Hsp90蛋白純化結(jié)果
            3.2.2.1 Ni柱純化結(jié)果
            3.2.2.2 陰離子交換層析(QHP柱)純化結(jié)果
            3.2.2.3 分子排阻層析純化結(jié)果
    3.3 Strep-tag II融合蛋白Hsp90 表達純化結(jié)果
        3.3.1 Strep柱純化結(jié)果
        3.3.2 WB驗證及質(zhì)譜鑒定Hsp90蛋白表達情況
        3.3.3 陰離子交換層析(QHP柱)純化結(jié)果
    3.4 小批量菌對照實驗的實驗結(jié)果
    3.5 Hsp90 蛋白ATP酶活性測定
    3.6 Hsp90蛋白的初步三維重構(gòu)
    3.7 小結(jié)
第四章 結(jié)果討論與研究展望
    4.1 結(jié)果討論
    4.2 研究展望
參考文獻
在學(xué)期間研究成果
致謝



本文編號：3776600