研究背景程序性死亡因子受體1（PD-1）是機體重要的免疫檢查點,它與配體組成的PD-1/PD-L1通路是免疫細胞衰竭、免疫功能損傷以及慢性病毒感染的重要機制,此外還與自身免疫疾病、移植物免疫排斥、異�；蛞约叭焉锵嚓P(guān)免疫疾病的調(diào)控密切相關(guān),這也讓靶向PD-1、PD-L1免疫療法或針對此療法的伴隨檢測成為近幾年的熱點研究。利用SELEX技術(shù)篩選的適體通過檢測生物標志物對疾病進行診斷、療效評估或作為PD-1/PD-L1抑制劑干擾、阻斷通路,推動PD-1/PD-L1靶標在疾病防治上發(fā)揮更大的應用價值。研究目的制備PD-1、PD-L1胞外片段可溶性重組蛋白,將二者作為靶標分別篩選其各自高特異性、高親和力適體,并對篩選的適體進行鑒定與表征。研究方法（1）采用基因工程技術(shù)構(gòu)建PD-1、PD-L1原核表達工程菌。經(jīng)發(fā)酵、裂解、包涵體處理、凝膠柱脫鹽、分離層析獲得純化重組蛋白。利用TricineSDS-PAGE、Western blot、肽質(zhì)量指紋圖譜、BCA測定等對重組蛋白檢測分析。（2）合成隨機ssDNA適體文庫,建立SELEX篩選方案。利用變性PAGE、qPCR、核酸定量、QCM等方法監(jiān)控篩選和... 

【文章頁數(shù)】：120 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 引言
    1.1PD-1和其配體PD-L1
    1.2 PD-1、PD-L1的結(jié)構(gòu)基因與信號通路
    1.3 PD-1/PD-L1通路的生物免疫學功能
        1.3.1 PD-1/PD-L1與腫瘤逃逸
        1.3.2 PD-1/PD-L1與慢性病毒感染
        1.3.3 PD-1/PD-L1與自身免疫性疾病
        1.3.4 PD-1/PD-L1與調(diào)節(jié)移植物排斥
        1.3.5 PD-1/PD-L1與妊娠免疫相關(guān)疾病
        1.3.6 PD-1/PD-L1與基因異常
    1.4 PD-1、PD-L1的醫(yī)學應用
    1.5 適體
        1.5.1 適體與SELEX技術(shù)
        1.5.2 適體的應用與優(yōu)勢
        1.5.3 適體篩選方案的建立
    1.6 本課題目的和意義
        1.6.1 研究目的
        1.6.2 課題意義
    1.7 技術(shù)路線圖
        1.7.1 課題的整體實驗思路
        1.7.2 PD-1、PD-L1重組蛋白制備路線圖
        1.7.3 適體篩選鑒定與表征路線圖
第2章 PD-1、PD-L1原核表達載體的構(gòu)建
    2.1 實驗材料、試劑與主要儀器
        2.1.1 目的基因、表達載體及引物的獲取
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 主要溶液配制
    2.2 實驗方法與步驟
        2.2.1 目的基因與載體的質(zhì)粒提取
        2.2.2 質(zhì)粒雙酶切
        2.2.3 瓊脂糖核酸電泳
        2.2.4 DNA的切膠回收和純化
        2.2.5 制備E.coli DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)
        2.2.6 DNA連接、轉(zhuǎn)化與克隆鑒定
        2.2.7 IPTG小劑量誘導表達蛋白
        2.2.8 Tricine-SDS-PAGE電泳
    2.3 實驗結(jié)果與分析
        2.3.1 DNA質(zhì)粒的雙酶切
        2.3.2 E.coli DH5α克隆載體的鑒定
        2.3.3 E.coli BL21 表達載體的鑒定
        2.3.4 誘導蛋白的可溶性分析
    2.4 本章小結(jié)與討論
        2.4.1 本章小結(jié)
        2.4.2 討論
第3章 包涵體的處理與蛋白純化、鑒定
    3.1 實驗材料、試劑與儀器
        3.1.1 主要試劑
        3.1.2 主要儀器
        3.1.3 主要溶液配制
    3.2 實驗方法與步驟
        3.2.1 乳糖培養(yǎng)液誘導表達
        3.2.2 包涵體的破碎處理
        3.2.3 包涵體的洗滌
        3.2.4 包涵體溶解
        3.2.5 Sephadex G-25 脫鹽
        3.2.6 蛋白超濾濃縮
        3.2.7 Sephacryl S-100 純化
        3.2.8 BCA法測定蛋白濃度
        3.2.9 純化蛋白的鑒定分析
    3.3 實驗結(jié)果與分析
        3.3.1 包涵體的處理
        3.3.2 G-25凝膠柱層析脫鹽
        3.3.3 Sephacryl S-100 凝膠柱層析純化
        3.3.4 重組蛋白的純度鑒定
        3.3.5 Western blot鑒定
        3.3.6 肽質(zhì)量指紋圖譜
    3.4 本章小結(jié)與討論
        3.4.1 本章小結(jié)
        3.4.2 討論
第4章 PD-1、PD-L1蛋白的適體的篩選
    4.1 實驗材料、試劑與儀器
        4.1.1 隨機單鏈寡核苷酸文庫及引物
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器
        4.1.4 主要溶液配制
    4.2 SELEX的初步探索及優(yōu)化
        4.2.1 PCR體系條件的優(yōu)化
        4.2.2 磁珠-蛋白偶聯(lián)率
        4.2.3 磁珠-核酸固定時間
    4.3 SELEX篩選方案
        4.3.1 氨基磁珠的活化
        4.3.2 靶蛋白PD-1、PD-L1的偶聯(lián)
        4.3.3 封閉
        4.3.4 結(jié)合ssDNA適體文庫
        4.3.5 洗脫未結(jié)合序列
        4.3.6 PCR擴增與回收純化
        4.3.7 磁珠分離法垂釣ssDNA次級文庫
        4.3.8 次級文庫的檢測
    4.4 實驗結(jié)果與分析
        4.4.1 PCR擴增的優(yōu)化探索
        4.4.2 磁珠-蛋白偶聯(lián)率
        4.4.3 磁珠-核酸最佳固定時間
        4.4.4 富集適體的擴增產(chǎn)物檢測
        4.4.5 次級文庫的檢測分析
        4.4.6 實時熒光定量PCR檢測
        4.4.7 石英晶體微天平(QCM)
    4.5 本章小結(jié)與討論
        4.5.1 本章小結(jié)
        4.5.2 討論
第5章 適體分子的克隆與表征
    5.1 實驗材料、試劑與儀器
    5.2 實驗方法
        5.2.1 富集適體產(chǎn)物的PCR擴增
        5.2.2 適體分子的克隆
        5.2.3 陽性克隆的鑒定
        5.2.4 斑點印跡雜交實驗(Dot bloting)
        5.2.5 凝膠阻滯實驗(EMSA)
    5.3 實驗結(jié)果與分析
        5.3.1 富集適體的PCR擴增
        5.3.2 陽性克隆的菌落PCR鑒定
        5.3.3 適體的序列分析
        5.3.4 Dot blot鑒定
        5.3.5 凝膠阻滯驗證
        5.3.6 Mfold二級結(jié)構(gòu)分析
    5.4 本章小結(jié)與討論
        5.4.1 本章小結(jié)
        5.4.2 討論
第6章 結(jié)論
    6.1 研究課題的總結(jié)
    6.2 論文的特色與創(chuàng)新點
        6.2.1 選題創(chuàng)新
        6.2.2 內(nèi)容創(chuàng)新
        6.2.3 成果創(chuàng)新
    6.3 需進一步開展的研究
參考文獻
致謝
個人簡歷、在學期間發(fā)表的學術(shù)論文與研究成果


【參考文獻】：
期刊論文
[1]黑斑側(cè)褶蛙Temporin基因內(nèi)含子在PCR擴增、克隆和Sanger測序過程中的復制跳躍[J]. 崔杰,林煜,徐艷春,楊淑慧.  野生動物學報. 2018(03)
[2]基于NHS基團修飾的副溶血性弧菌免疫磁珠制備及其富集性能評價[J]. 劉陽,劉文俠,孫力軍,施琦,邱妹,鄧旗.  安徽農(nóng)業(yè)科學. 2018(06)
[3]PD-1/PD-L1在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血表達水平及其臨床意義[J]. 邵康,張晨星,趙莉,吳標,王穎.  現(xiàn)代免疫學. 2014(05)
[4]富集H5N1亞型禽流感病毒生物磁珠的制備[J]. 張馨元,李志萍,李乾學,夏志平,馬紅霞.  中國獸醫(yī)學報. 2014(09)
[5]轉(zhuǎn)基因玉米EPSPS蛋白適體的篩選與結(jié)構(gòu)分析[J]. 江樹勛,黃新,邵碧英,陳敏,陳洪俊,陳文炳,吳亞君,潘大仁.  熱帶作物學報. 2010(04)
[6]一種基于肽質(zhì)量指紋譜技術(shù)鑒定蓖麻毒素的新方法[J]. 閆妍,張淑珍,唐吉軍,顧明松,馮建林,謝劍煒.  分析化學. 2006(02)

博士論文
[1]核酸結(jié)合蛋白的預測研究[D]. 張曉利.華中科技大學 2017

碩士論文
[1]抗精子適體的制備及其抑精功能的初步研究[D]. 王一杏.華僑大學 2015
[2]EHEC O157:H7和空腸彎曲菌氨基磁珠-LAMP檢測方法的建立[D]. 王雪.華中農(nóng)業(yè)大學 2015
[3]基于適體技術(shù)體外檢測血管內(nèi)皮生長因子165[D]. 馬靜.華僑大學 2014



本文編號：3710729