發(fā)布時(shí)間：2022-12-05 18:49

　　miR396是植物體內(nèi)一類(lèi)高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA,在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)靶基因的表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用,參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成、激素應(yīng)答以及生物與非生物脅迫等多種生理生化反應(yīng)。為初步探討AtmiR396對(duì)擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育的影響,本文以哥倫比亞野生型擬南芥以及利用CRISPR/Cas9基因定點(diǎn)編輯技術(shù)所獲得的AtmiR396純合突變體為研究對(duì)象,通過(guò)觀測(cè)表型、測(cè)定抗氧化酶的活性、比較miR396的靶基因GRFs以及CKXs基因的表達(dá)、分析差異表達(dá)基因（DEGs）以初步確定擬南芥AtmiR396的功能。主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下:1.根據(jù)AtmiR396a和AtmiR396b序列分別設(shè)計(jì)2個(gè)sgRNA,經(jīng)PCR擴(kuò)增目的片段大小在500-750 bp之間,與預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度592 bp大小相一致。Bsa1酶切pHDE-mCherry質(zhì)粒,質(zhì)粒線性化,可與目的片段組裝成重組質(zhì)粒pHDE-mCherry-AtmiR396。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,菌液PCR鑒定結(jié)果顯示,目標(biāo)條帶大小位于500-750 bp之間,與預(yù)期大小相符。提取重組質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒PCR鑒定,條帶大小符合預(yù)期,初步判定pH... 

【文章頁(yè)數(shù)】：79 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 緒論
    1.1 miRNA概述
        1.1.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)
        1.1.2 miRNA的合成機(jī)制
        1.1.3 miRNA的作用機(jī)理
        1.1.4 miRNA的功能
        1.1.5 植物miRNA功能的研究方法
    1.2 植物miR396 功能及研究進(jìn)展
        1.2.1 miR396 簡(jiǎn)介
        1.2.2 miR396 在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用
        1.2.3 miR396 在植物脅迫應(yīng)答反應(yīng)中的調(diào)控作用
    1.3 CRISPR/Cas9 技術(shù)發(fā)展及其在植物中的應(yīng)用進(jìn)展
        1.3.1 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的組成及工作原理
        1.3.2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的不足
        1.3.3 CRISPR/Cas9 技術(shù)在植物基因組定向編輯中的應(yīng)用
    1.4 研究?jī)?nèi)容、目的意義及技術(shù)路線
        1.4.1 研究?jī)?nèi)容
        1.4.2 研究目的及意義
        1.4.3 技術(shù)路線
第二章 材料與方法
    2.1 材料與試劑
        2.1.1 試驗(yàn)材料
        2.1.2 主要試劑
    2.2 儀器與設(shè)備
    2.3 試驗(yàn)方法
        2.3.1 擬南芥AtmiR396的CRISPR/Cas9 載體構(gòu)建
        2.3.2 重組質(zhì)粒pHDE-mCherry-AtmiR396 轉(zhuǎn)化擬南芥
        2.3.3 轉(zhuǎn)化后代的篩選與鑒定
        2.3.4 突變體的表型觀測(cè)
        2.3.5 抗氧化酶活性的測(cè)定
        2.3.6 AtmiR396a突變體GRFs與 CKXs基因的表達(dá)差異研究
        2.3.7 擬南芥AtmiR396a突變體的轉(zhuǎn)錄組分析
    2.4 數(shù)據(jù)處理
        2.4.1 抗氧化酶活性的數(shù)據(jù)處理
        2.4.2 AtmiR396a突變體GRFs與 CKXs基因的表達(dá)差異數(shù)據(jù)處理
第三章 結(jié)果與分析
    3.1 pHDE-mCherry-AtmiR396 表達(dá)載體構(gòu)建
    3.2 重組質(zhì)粒pHDE-mCherry-AtmiR396 轉(zhuǎn)化擬南芥
    3.3 轉(zhuǎn)化后代的篩選與鑒定
        3.3.1 T_0 代轉(zhuǎn)化后代的可視化篩選
        3.3.2 T1 突變后代的篩選及外源轉(zhuǎn)化元件的驗(yàn)證
        3.3.3 T2 突變后代的穩(wěn)定遺傳鑒定及外源轉(zhuǎn)化元件分離驗(yàn)證
        3.3.4 突變體的表型觀測(cè)
    3.4 抗氧化酶的活性測(cè)定
        3.4.1 SOD活性的測(cè)定
        3.4.2 POD活性的測(cè)定
        3.4.3 CAT活性的測(cè)定
        3.4.4 PPO活性的測(cè)定
    3.5 AtmiR396a突變體GRFs與 CKXs基因的表達(dá)差異研究
        3.5.1 RNA的提取
        3.5.2 GRFs與 CKXs的擴(kuò)增效果研究
        3.5.3 基因表達(dá)分析
    3.6 擬南芥AtmiR396a突變體的轉(zhuǎn)錄組分析
        3.6.1 RNA-seq測(cè)序質(zhì)量評(píng)估
        3.6.2 差異表達(dá)基因分析
        3.6.3 差異表達(dá)基因GO富集分析
        3.6.4 差異表達(dá)基因KEGG富集分析
第四章 討論
    4.1 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)的優(yōu)勢(shì)
    4.2 抗氧化酶活性研究
    4.3 AtmiR396a突變體GRFs與 CKXs基因的表達(dá)差異研究
    4.4 擬南芥AtmiR396a突變體的轉(zhuǎn)錄組分析
第五章 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
作者簡(jiǎn)介
導(dǎo)師簡(jiǎn)介
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]基于Cas9-Free的擬南芥ALB3基因編輯載體構(gòu)建及驗(yàn)證[J]. 馬銘賽,布梁灝,陳自銀,黃嘉玲,歐陽(yáng)樂(lè)軍,李莉梅,王玉濤.  華北農(nóng)學(xué)報(bào). 2020(01)
[2]一種擬南芥基因高效編輯體系研究[J]. 歐陽(yáng)樂(lè)軍,馬銘賽,陳梓洛,黃嘉玲,布梁灝,陳自銀,李莉梅.  植物研究. 2019(06)
[3]巨桉miR156 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建[J]. 歐陽(yáng)樂(lè)軍,袁玉梅,李莉梅,陳剴釗,戴發(fā).  森林與環(huán)境學(xué)報(bào). 2018(04)
[4]玫瑰花多酚氧化酶的酶學(xué)特性研究[J]. 姬懿珊,馮作山,劉峰娟,劉偉君,陶永霞.  新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2018(03)
[5]毛竹miR164b前體的克隆及其在葉形態(tài)建成中的功能分析[J]. 王麗麗,李利超,孫化雨,趙韓生,高志民.  植物科學(xué)學(xué)報(bào). 2017(04)
[6]miR396-GRF模塊:水稻分子育種的新資源[J]. 劉玲童,王臺(tái).  植物學(xué)報(bào). 2016(02)
[7]CRISPR/Cas技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 常振儀,嚴(yán)維,劉東風(fēng),陳竹鋒,謝剛,盧嘉威,吳建新,唐曉艷.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2015(09)
[8]兩種檢測(cè)SOD酶活性方法的比較[J]. 曲敏,秦麗楠,劉羽佳,范宏臣,朱姝,王金鳳.  食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào). 2014(10)
[9]植物安全轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究現(xiàn)狀與展望[J]. 王根平,杜文明,夏蘭琴.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2014(05)
[10]植物激素相關(guān)microRNA研究進(jìn)展[J]. 曹慧穎,王可,高何瑞,張立軍,夏潤(rùn)璽.  植物生理學(xué)報(bào). 2013(11)

博士論文
[1]miR396在番茄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育中的功能研究[D]. 曹東艷.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
[2]赤霉素對(duì)細(xì)胞壁組分以及擬南芥主根伸長(zhǎng)的影響[D]. 李桂俊.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015

碩士論文
[1]開(kāi)花與未開(kāi)花三月竹幾種重要代謝物差異研究[D]. 王雙燕.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[2]糖對(duì)擬南芥幼苗初生根生長(zhǎng)影響的研究[D]. 王治.中央民族大學(xué) 2011
[3]MiR396在煙草中的功能分析[D]. 楊鳳璽.中國(guó)科學(xué)院研究生院（西雙版納熱帶植物園） 2009



本文編號(hào)：3710164