本文關(guān)鍵詞：α2巨球蛋白在文昌魚受精卵中的存在及其抑菌作用分析—頭索動物母源性免疫新證據(jù)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：與哺乳動物相比,大多數(shù)水生動物將其卵子釋放到充滿病原菌的水環(huán)境中,并且在水中完成受精以及進行胚胎發(fā)育。那么發(fā)育中的胚胎在自身免疫系統(tǒng)成熟之前是怎樣保護自身免受病菌的侵害呢?這是一個非常有意義的問題,但是依然沒有很好的得到解決。在魚類中,已經(jīng)證明許多母源性免疫因子可以通過不同的作用模式來為早期發(fā)育中的胚胎提供保護。無脊椎動物缺乏產(chǎn)生抗體的能力,但是在一些物種也發(fā)現(xiàn)了被動免疫的母體傳遞現(xiàn)象。但是,對于無脊椎動物的母源性免疫尤其是母源性免疫組分的研究數(shù)據(jù)非常有限。α2巨球蛋(alpha2 macroglobulin, A2m)是一種廣譜性蛋白酶抑制劑,能夠抑制內(nèi)源性的或者來自入侵病菌的外源性蛋白酶,被認為是進化過程中天然免疫系統(tǒng)中的保守組成部分。頭索動物文昌魚是現(xiàn)存的與脊椎動物親緣關(guān)系最近的無脊椎動物。已有實驗證明在文昌魚的卵巢中檢測到了A2m mRNA的表達,這使我們設(shè)想A2m是否會作為一個母源性的免疫因子存在于受精卵中,并且在胚胎早期發(fā)育過程中發(fā)揮防御功能?基于如上,我們首先檢測文昌魚的卵液是否能有效抑制細菌的生長,如果能夠,則驗證A2m是否作為一種母源性免疫因子存在于受精卵中,并且參與卵液的抑菌作用。在本研究中,我們首先制備了的1-2cell時期文昌魚受精卵卵液,并進行了抑菌實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn),文昌魚的卵液能夠有效的抑制大腸桿菌(E.coli,革蘭氏陰性菌)和金黃色葡萄球菌(S. aureus,革蘭氏陽性菌)的生長,而且其抑菌活性與卵液的濃度有明顯的祖關(guān)性。其次,利用基因克隆、原核表達技和蛋白分離純化技術(shù)獲得了文昌魚A2m重組蛋白,并用純化后的A2m重組蛋白作為抗原對新西蘭兔子進行免疫注射,制備了抗A2m的抗血清。為了鑒定A2m是否存在于文昌魚的受精卵中,則將卵液進行了SDS-PAGE電泳,分別用商業(yè)化的抗-人A2m抗體和自制的抗-文昌魚A2m抗血清進行了免疫印跡(Western blotting)檢測,結(jié)果分別獲得一條分子量約為170kDa的陽性條帶,這與文昌魚A2m相對分子量大小相一致。這充分證明了A2m作為一種母源性免疫因子存在于頭索動物文昌魚受精卵中。在文昌魚受精卵中,母源性的A2m除了以蛋白形式存在之外,是否也存在其1mRNA呢?因此,我們利用地高辛標記的A2m RNA探針對1-4細胞時期胚胎進行了原位雜交,結(jié)果在受精卵中檢測到了明顯的陽性信號。這說明了受精卵中存在母源性的A2m mRNA。進一步,我們利用實時定量PCR技術(shù)對不同發(fā)育時期胚胎的A2m表達水平進行了分析。發(fā)現(xiàn),1-4細胞時期中mRNA的豐度最高。這與原位雜交結(jié)果相互印證,充分證明了母源性A2m mRNA存于文昌魚卵子中。因此,A2m作為母源性免疫因子以蛋白和mRNA兩種形式并存于文昌(魚受精卵中)。為了探索母源性的A2m是否在卵液抑菌活性中發(fā)揮作用,我們又進行了一系列的實驗。首先,當利用抗體沉淀A2m后,發(fā)現(xiàn)卵液對大腸桿菌和葡萄球菌的抑菌活性發(fā)生明顯降低。這說明,母源性的A2m在一定程度上參與了卵液的抑菌作用。此外,研究還發(fā)現(xiàn)重折疊的A2m重組蛋白可以抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長,并呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。進一步研究發(fā)現(xiàn),利用FITC熒光素標記的A2m蛋白可以與大腸桿菌進行有效地結(jié)合。除此之外,通過掃描電鏡技術(shù)研究了A2m和大腸桿菌的相互作用,發(fā)現(xiàn)A2m能夠使大腸桿菌細胞發(fā)生皺縮,甚至破壞它們的結(jié)構(gòu)。這些數(shù)據(jù)表明,母源性的A2m在卵液的抑菌中發(fā)揮了重要作用,可能直接作用于細菌。綜上所述,頭索動物文昌魚的卵液具有抑菌活性。其中,A2m作為一種重要的母源性免疫因子存在于受精卵中,并在卵液的抑菌作用中扮演了重要的角色。毫無疑問,本研究為探討無脊椎動物母源性免疫防御機制提供了新的證據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：文昌魚 母源性免疫 α2巨球蛋白 抑菌活性
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q954.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第一章 文獻綜述13-26
• 1. 母源性免疫13-17
• 1.1 母源性免疫的研究進展13-16
• 1.2 影響母源性免疫傳遞的因素16
• 1.3 母源性免疫的功能和意義16-17
• 1.4 母源性免疫的應(yīng)用前景分析17
• 2. 文昌魚的介紹17-20
• 2.1 文昌魚的發(fā)現(xiàn)與定名、分布17-18
• 2.2 文昌魚的生活習性18
• 2.3 文昌魚的生殖腺18-19
• 2.4 文昌魚的生殖與胚胎發(fā)育19
• 2.5 文昌魚的進化地位與價值19-20
• 3. A2m的研究20-24
• 3.1 A2m的形式與結(jié)構(gòu)20
• 3.2 A2m的特性20
• 3.3 A2m的存在與位置20-21
• 3.4 A2m的功能21-23
• 3.5 A2m的系統(tǒng)進化23-24
• 4. 研究目的意義和技術(shù)路線24-26
• 4.1 研究目的意義24-25
• 4.2 技術(shù)路線25-26
• 第二章 文昌魚卵液的抑菌作用分析26-30
• 1. 前言26
• 2. 材料與方法26-28
• 2.1 文昌魚受精卵液的制備26-27
• 2.2 文昌魚1-2cell時期受精卵液的抑菌實驗27-28
• 3. 結(jié)果28-29
• 3.1 文昌魚受精卵液的抑菌作用28-29
• 4. 討論29-30
• 第三章：A2m在文昌魚受精卵中的鑒定與分析30-64
• 1. 前言30
• 2. 材料與方法30-55
• 2.1 文昌魚A2m基因序列的克隆30-37
• 2.2 重組蛋白pET-32a—A2m的原核表達與鑒定37-48
• 2.3 抗文昌魚A2m抗血清的制備48
• 2.4 SDS-PAGE和Western blotting48-49
• 2.5 原位雜交49-54
• 2.6 實時定量PCR54-55
• 3. 結(jié)果55-63
• 3.1 文昌魚A2m基因序列的克隆結(jié)果55-57
• 3.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達、純化及、鑒定及抗血清的制備結(jié)果57-61
• 3.3 文昌魚受精卵液中A2m蛋白的存在性分析61
• 3.4 1細胞時期胚胎(受精卵)的原位雜交結(jié)果61-62
• 3.5 實時定量PCR結(jié)果62-63
• 4. 討論63-64
• 第四章 A2m在文昌魚卵液抑菌活性中的作用分析64-71
• 1. 前言64
• 2. 材料與方法64-66
• 2.1 文昌魚卵液中A2m的抑菌作用分析64-65
• 2.2 復(fù)性重組蛋白A2m的抑菌機制分析65-66
• 2.3 統(tǒng)計分析66
• 3. 結(jié)果66-70
• 3.1 受精卵液中的A2m在抑菌活性中的作用66-67
• 3.2 復(fù)性重組蛋白A2m的抑菌機制67-70
• 4. 討論70-71
• 總結(jié)與展望71-73
• 參考文獻73-80
• 附錄80-81
• 致謝81-82
• 個人簡歷82-83
• 學術(shù)論文83

【參考文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：α2巨球蛋白在文昌魚受精卵中的存在及其抑菌作用分析—頭索動物母源性免疫新證據(jù)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：370801