阿維菌素（Avermectin）是由阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）產(chǎn)生的一類具有殺蟲、殺螨等活性的十六元大環(huán)內(nèi)酯類化合物,其殺蟲譜廣、藥效持久已獲得諾貝爾獎承認。阿維菌素的生物合成研究始于20多年前,由于阿維菌素在實際應用中的重要性,其生物合成機制也一直是微生物遺傳學及生物化學領(lǐng)域的熱點問題。其生物合成途徑中存在一種細胞色素P450單加氧酶（Cytochrome P450 enzymes,CYP450）AveE,被認為參與催化阿維菌素前體后修飾的第一步反應,但AveE的功能僅僅是由體內(nèi)敲除預測的,其體外酶活有待闡明。細胞色素P450酶是一類含有亞鐵血紅素催化中心的蛋白超家族,具有分布廣泛、功能多樣化等特點,被譽為“生物界的萬能催化劑”。絕大多數(shù)P450都會借助還原伴侶蛋白傳遞電子完成催化反應。在細菌中,常見的還原伴侶蛋白系統(tǒng)是由包含黃素腺嘌呤二核苷酸FAD的鐵氧還蛋白還原酶（Ferredoxin Reductase,FdR）和由包含鐵硫簇的鐵氧還蛋白（Ferredoxin,Fdx）組成的Ⅰ類還原伴侶系統(tǒng),負責將來自于輔因子NAD（P）H的電子沿傳遞鏈“N... 

【文章頁數(shù)】：109 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 引言
    1.1細胞色素P450
        1.1.1 細胞色素P450簡介
        1.1.2 細胞色素P450的催化機理
    1.2 阿維菌素生物合成研究進展
        1.2.1 阿維菌素的化學結(jié)構(gòu)及其應用
        1.2.2 阿維菌素生物合成相關(guān)基因的功能分析
    1.3 基因編輯技術(shù)及CRISPR/cas9
        1.3.1 基因編輯技術(shù)
        1.3.2 CRISPR/cas9
        1.3.3 CRISPR/cas9 技術(shù)在放線菌基因組編輯中的應用
    1.4 本研究的目的及意義
第二章 阿維鏈霉菌還原伴侶的表達與純化
    2.1 實驗材料及方法
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 試劑
        2.1.3 引物設計
        2.1.4 基因的克隆與表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.1.5 還原伴侶蛋白的表達與純化
        2.1.6 大腸桿菌化學感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化
        2.1.7 還原伴侶濃度的測定
    2.2 實驗結(jié)果與分析
    2.3 本章小結(jié)
第三章 單加氧酶AveE的表達及純化
    3.1 單加氧酶AveE在大腸桿菌中的表達
        3.1.1 菌株和質(zhì)粒
        3.1.2 試劑
        3.1.3 引物設計
        3.1.4 基因克隆和表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.1.5 重組蛋白的表達及純化
        3.1.6 蛋白濃度的測定
    3.2 單加氧酶AveE在鏈霉菌中的表達
        3.2.1 菌株和質(zhì)粒
        3.2.2 試劑
        3.2.3 引物設計
        3.2.4 鏈霉菌孢子懸液的制備和保存
        3.2.5 鏈霉菌基因組的提取
        3.2.6 基因克隆和表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.7 大腸桿菌化學感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化
        3.2.8 接合轉(zhuǎn)移
        3.2.9 蛋白的表達及純化
        3.2.10 蛋白濃度的測定
    3.3 實驗結(jié)果與分析
        3.3.1 載體構(gòu)建
        3.3.2 鏈霉菌菌落PCR結(jié)果
        3.3.3 單加氧酶AveE的表達及純化
    3.4 本章小結(jié)
第四章 阿維鏈霉菌aveE及 aveBI-BVIII敲除菌株的構(gòu)建
    4.1 實驗材料及方法
        4.1.1 菌株和質(zhì)粒
        4.1.2 試劑
        4.1.3 引物設計
        4.1.4 基因克隆和質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.1.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)ET12567/pUZ8002
        4.1.6 野生型菌株抗性檢測
        4.1.7 接合、篩選及質(zhì)粒自殺
        4.1.8 菌落PCR篩選轉(zhuǎn)基因鏈霉菌
        4.1.9 鏈霉菌的發(fā)酵
        4.1.10 發(fā)酵產(chǎn)物的分析
    4.2 實驗結(jié)果與分析
        4.2.1 野生型菌株抗性檢測
        4.2.2 CRISPR/cas9質(zhì)粒構(gòu)建
        4.2.3 菌落PCR驗證
        4.2.4 抗性篩選驗證
        4.2.5 阿維鏈霉菌的發(fā)酵
        4.2.6 發(fā)酵產(chǎn)物的分析
    4.3 本章小結(jié)
第五章 AveE體外酶活驗證
    5.1 實驗材料及方法
        5.1.1 試劑
        5.1.2 反應體系
    5.2 實驗結(jié)果與分析
第六章 討論
結(jié)論與展望
參考文獻
附錄
    附錄1 縮略語
    附錄2 主要儀器
    附錄3 主要試劑
    附錄4 培養(yǎng)基和溶液
    附錄5 基因序列
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]細胞色素P450酶與微生物藥物創(chuàng)制[J]. 李眾,張偉,李盛英.  微生物學報. 2016(03)

碩士論文
[1]應用CRISPR/Cas9技術(shù)定向突變煙草CYP71D16基因的研究[D]. 田茂竹.貴州大學 2019
[2]TEV酶在大腸桿菌中的融合表達及其分析方法研究[D]. 張軍輝.華南農(nóng)業(yè)大學 2016



本文編號：3695361