大白菜（Brassica rapa ssp. pekinensis）是十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica）葉用蔬菜。硫代葡萄糖苷（Glucosinolates, GS,簡稱硫苷）,是一種在十字花科植物中廣泛存在的植物次生代謝產(chǎn)物,具有多種不同功能。本實驗通過克隆大白菜’chiifu’中的BrCYP79B2（BrCYP79B2-1、BrCYP79B2-2、BrCYP79B2-3）和BrCYP79B3啟動子,構建GUS表達載體,轉化擬南芥,分析它們的表達水平差異,為研究這些基因在吲哚族硫苷合成途徑中的功能分化奠定基礎。主要研究結果如下：（1）根據(jù)Brassica Database和BrGDB Query確定BrCYP79B2（BrCYP79B2-1、 BrCYP79B2-2、BrCYP79B2-3）和BrCYP79B3啟動子的長度與位置,用軟件Primer Premier5設計特異引物。（2）克隆BrCYP79B2（BrCYP79B2-1、BrCYP79B2-2、BrCYP79B2-3）和BrCYP79B3啟動子。分析這些啟動子序列元件,發(fā)現(xiàn)它們不僅含有TATA-bo... 

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【學位級別】：碩士

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摘要
ABSTRACT
1 文獻綜述
    1.1 大白菜
    1.2 硫代葡萄糖苷概況及其功能
        1.2.1 硫代葡萄糖苷的化學結構
        1.2.2 硫代葡萄糖苷合成的影響因素
            1.2.2.1 基因型對硫代葡萄糖苷的影響
            1.2.2.2 光對硫代葡萄糖苷的影響
            1.2.2.3 溫度對硫代葡萄糖苷的影響
            1.2.2.4 水分對硫代葡萄糖苷的影響
            1.2.2.5 硫、氮元素對硫代葡萄糖苷的影響
            1.2.2.6 鹽脅迫對硫代葡萄糖苷的影響
            1.2.2.7 機械損傷和昆蟲取食對硫代葡萄糖苷的影響
            1.2.2.8 激素對硫代葡萄糖苷的影響
    1.3 啟動子的特征與結構
        1.3.1 啟動子特征簡介
        1.3.2 啟動子的結構
            1.3.2.1 核心啟動元件
            1.3.2.2 上游(或下游)啟動元件
    1.4 啟動子分類
        1.4.1 組成型啟動子
            1.4.1.1 來自非植物自身的組成型啟動子
            1.4.1.2 來自植物自身的啟動子
        1.4.2 組織特異性啟動子
            1.4.2.1 果實特異性啟動子
            1.4.2.2 莖葉特異性啟動子
            1.4.2.3 根特異性啟動子
        1.4.3 誘導型啟動子
            1.4.3.1 光誘導表達啟動子
            1.4.3.2 熱誘導表達啟動子
            1.4.3.3 創(chuàng)傷誘導表達啟動子
            1.4.3.4 其他表達啟動子
    1.5 CKP79基因家族的研究進展
    1.6 本研究的目的及意義
2 試驗材料與方法
    2.1 試驗材料
    2.2 實驗儀器和試劑
    2.3 BrCYP79B2/B3啟動子克隆及擬南芥轉化
        2.3.1 大白菜DNA提取
            2.3.1.1 DNA提取試劑盒提取大白菜‘chiifu’總DNA
            2.3.1.2 DNA凝膠電泳檢測
        2.3.2 BrCYP79B2/B3啟動子的克隆
            2.3.2.1 引物設計
            2.3.2.2 PCR擴增
            2.3.2.3 擴增產(chǎn)物凝膠電泳檢測
        2.3.3 植物克隆載體的構建
            2.3.3.1 PCR產(chǎn)物切膠回收
            2.3.3.2 目的片段與載體連接構建
            2.3.3.3 連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌
            2.3.3.4 單克隆菌體挑取,培養(yǎng)及PCR檢測
            2.3.3.5 菌液PCR凝膠電泳檢測
            2.3.3.6 啟動子序列分析
        2.3.4 表達載體的構建
            2.3.4.1 質粒提取
            2.3.4.2 酶切質粒DNA
            2.3.4.3 連接并構建表達載體
            2.3.4.4 農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞制備
            2.3.4.5 凍融法轉化農(nóng)桿菌
            2.3.4.6 單克隆菌體挑取,培養(yǎng)及PCR檢測
            2.3.4.7 菌液PCR凝膠電泳檢測
        2.3.5 轉基因植株的獲得
            2.3.5.1 擬南芥播種及培養(yǎng)
            2.3.5.2 花序侵染法轉化擬南芥
            2.3.5.3 篩選轉基因擬南芥
    2.4 轉基因植株GUS組織化學染色
        2.4.1 不同處理對BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3啟動子在轉基因擬南芥中表達的影響
    2.5 qRT-PCR分析NaCl、MeJA、Kyn、AOA對BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3啟動子表達變化的影響
        2.5.1 RNA提取及檢測
            2.5.1.1 Trizol法提取RNA
            2.5.1.2 RNA凝膠電泳檢測
        2.5.2 去除RNA中基因組DNA并進行反轉錄成為cDNA
        2.5.3 qRT-PCR
3 結果與分析
    3.1 大白菜‘chiifu’基因組DNA提取
    3.2 BrCYP79B2/B3啟動子的克隆
    3.3 啟動子序列分析
    3.4 啟動子驅動的GUS基因植物表達載體構建
        3.4.1 啟動子載體的酶切鑒定
        3.4.2 農(nóng)桿菌中質粒鑒定
    3.5 轉基因擬南芥的獲得
    3.6 轉基因擬南芥PCR檢測
    3.7 ProB_(2-1):GUS、ProB_(2-3)：GUS的組織特異性分析
        3.7.1 子葉期各啟動子的組織表達模式
        3.7.2 蓮座期期各啟動子的組織表達模式
        3.7.3 抽薹開花期各啟動子的組織表達模式
        3.7.4 成熟期各啟動子的組織表達模式
        3.7.5 不同處理對BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3啟動子在轉基因擬南芥中表達的影響
    3.8 qRT-PCR分析NaCl、MeJA、Kyn、AOA對BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3啟動子表達的影響
4 討論
5 結論
    5.1 BrCYP79B2-1、BrCYP79B2-2、BrCYP79B2-3和BrCYP79B3啟動子區(qū)域分析
    5.2 BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3啟動子的表達模式具有相似性
    5.3 BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3啟動子的表達模式具有各自特異部位
    5.4 不同處理對BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3啟動子表達量影響不同
    5.5 BrCYP79B2-1和BrCYP7982-3啟動子受NaCl、MeJA、Kyn、AOA影響的差異和相似性
參考文獻
個人簡介
致謝



本文編號：3676186