大白菜（Brassica rapa ssp. pekinensis）是十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica）葉用蔬菜。硫代葡萄糖苷（Glucosinolates, GS,簡稱硫苷）,是一種在十字花科植物中廣泛存在的植物次生代謝產(chǎn)物,具有多種不同功能。本實驗通過克隆大白菜’chiifu’中的BrCYP79B2（BrCYP79B2-1、BrCYP79B2-2、BrCYP79B2-3）和BrCYP79B3啟動子,構(gòu)建GUS表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化擬南芥,分析它們的表達(dá)水平差異,為研究這些基因在吲哚族硫苷合成途徑中的功能分化奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：（1）根據(jù)Brassica Database和BrGDB Query確定BrCYP79B2（BrCYP79B2-1、 BrCYP79B2-2、BrCYP79B2-3）和BrCYP79B3啟動子的長度與位置,用軟件Primer Premier5設(shè)計特異引物。（2）克隆BrCYP79B2（BrCYP79B2-1、BrCYP79B2-2、BrCYP79B2-3）和BrCYP79B3啟動子。分析這些啟動子序列元件,發(fā)現(xiàn)它們不僅含有TATA-bo... 

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 大白菜
    1.2 硫代葡萄糖苷概況及其功能
        1.2.1 硫代葡萄糖苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)
        1.2.2 硫代葡萄糖苷合成的影響因素
            1.2.2.1 基因型對硫代葡萄糖苷的影響
            1.2.2.2 光對硫代葡萄糖苷的影響
            1.2.2.3 溫度對硫代葡萄糖苷的影響
            1.2.2.4 水分對硫代葡萄糖苷的影響
            1.2.2.5 硫、氮元素對硫代葡萄糖苷的影響
            1.2.2.6 鹽脅迫對硫代葡萄糖苷的影響
            1.2.2.7 機(jī)械損傷和昆蟲取食對硫代葡萄糖苷的影響
            1.2.2.8 激素對硫代葡萄糖苷的影響
    1.3 啟動子的特征與結(jié)構(gòu)
        1.3.1 啟動子特征簡介
        1.3.2 啟動子的結(jié)構(gòu)
            1.3.2.1 核心啟動元件
            1.3.2.2 上游(或下游)啟動元件
    1.4 啟動子分類
        1.4.1 組成型啟動子
            1.4.1.1 來自非植物自身的組成型啟動子
            1.4.1.2 來自植物自身的啟動子
        1.4.2 組織特異性啟動子
            1.4.2.1 果實特異性啟動子
            1.4.2.2 莖葉特異性啟動子
            1.4.2.3 根特異性啟動子
        1.4.3 誘導(dǎo)型啟動子
            1.4.3.1 光誘導(dǎo)表達(dá)啟動子
            1.4.3.2 熱誘導(dǎo)表達(dá)啟動子
            1.4.3.3 創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達(dá)啟動子
            1.4.3.4 其他表達(dá)啟動子
    1.5 CKP79基因家族的研究進(jìn)展
    1.6 本研究的目的及意義
2 試驗材料與方法
    2.1 試驗材料
    2.2 實驗儀器和試劑
    2.3 BrCYP79B2/B3啟動子克隆及擬南芥轉(zhuǎn)化
        2.3.1 大白菜DNA提取
            2.3.1.1 DNA提取試劑盒提取大白菜‘chiifu’總DNA
            2.3.1.2 DNA凝膠電泳檢測
        2.3.2 BrCYP79B2/B3啟動子的克隆
            2.3.2.1 引物設(shè)計
            2.3.2.2 PCR擴(kuò)增
            2.3.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測
        2.3.3 植物克隆載體的構(gòu)建
            2.3.3.1 PCR產(chǎn)物切膠回收
            2.3.3.2 目的片段與載體連接構(gòu)建
            2.3.3.3 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌
            2.3.3.4 單克隆菌體挑取,培養(yǎng)及PCR檢測
            2.3.3.5 菌液PCR凝膠電泳檢測
            2.3.3.6 啟動子序列分析
        2.3.4 表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.3.4.1 質(zhì)粒提取
            2.3.4.2 酶切質(zhì)粒DNA
            2.3.4.3 連接并構(gòu)建表達(dá)載體
            2.3.4.4 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備
            2.3.4.5 凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
            2.3.4.6 單克隆菌體挑取,培養(yǎng)及PCR檢測
            2.3.4.7 菌液PCR凝膠電泳檢測
        2.3.5 轉(zhuǎn)基因植株的獲得
            2.3.5.1 擬南芥播種及培養(yǎng)
            2.3.5.2 花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥
            2.3.5.3 篩選轉(zhuǎn)基因擬南芥
    2.4 轉(zhuǎn)基因植株GUS組織化學(xué)染色
        2.4.1 不同處理對BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3啟動子在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)的影響
    2.5 qRT-PCR分析NaCl、MeJA、Kyn、AOA對BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3啟動子表達(dá)變化的影響
        2.5.1 RNA提取及檢測
            2.5.1.1 Trizol法提取RNA
            2.5.1.2 RNA凝膠電泳檢測
        2.5.2 去除RNA中基因組DNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成為cDNA
        2.5.3 qRT-PCR
3 結(jié)果與分析
    3.1 大白菜‘chiifu’基因組DNA提取
    3.2 BrCYP79B2/B3啟動子的克隆
    3.3 啟動子序列分析
    3.4 啟動子驅(qū)動的GUS基因植物表達(dá)載體構(gòu)建
        3.4.1 啟動子載體的酶切鑒定
        3.4.2 農(nóng)桿菌中質(zhì)粒鑒定
    3.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得
    3.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR檢測
    3.7 ProB_(2-1):GUS、ProB_(2-3)：GUS的組織特異性分析
        3.7.1 子葉期各啟動子的組織表達(dá)模式
        3.7.2 蓮座期期各啟動子的組織表達(dá)模式
        3.7.3 抽薹開花期各啟動子的組織表達(dá)模式
        3.7.4 成熟期各啟動子的組織表達(dá)模式
        3.7.5 不同處理對BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3啟動子在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)的影響
    3.8 qRT-PCR分析NaCl、MeJA、Kyn、AOA對BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3啟動子表達(dá)的影響
4 討論
5 結(jié)論
    5.1 BrCYP79B2-1、BrCYP79B2-2、BrCYP79B2-3和BrCYP79B3啟動子區(qū)域分析
    5.2 BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3啟動子的表達(dá)模式具有相似性
    5.3 BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3啟動子的表達(dá)模式具有各自特異部位
    5.4 不同處理對BrCYP79B2-1和BrCYP79B2-3啟動子表達(dá)量影響不同
    5.5 BrCYP79B2-1和BrCYP7982-3啟動子受NaCl、MeJA、Kyn、AOA影響的差異和相似性
參考文獻(xiàn)
個人簡介
致謝



本文編號：3676186