慢生單胞菌為分離自海洋沉積物中的捕食性細菌類群,其分離工作的難度較高,因此對于該類群檢測方法的研究,對確定其在環(huán)境中的分布情況以及與其他類群相關關系分析有著重要意義。本研究針對慢生單胞菌目設計出了特異性的寡核苷酸探針,并通過純培養(yǎng)菌株實驗對其嚴謹性及覆蓋度進行了驗證。根據(jù)探針序列設計并合成一對熒光定量PCR引物。實驗驗證發(fā)現(xiàn)所設計出的寡核苷酸探針可以與目前已培養(yǎng)的所有慢生單胞菌物種進行雜交,同時與本實驗所選擇的非目標類群雜交結果為陰性。進而選取了文登鹽場5個不同鹽度梯度的鹽池以及運城鹽湖6個鹽池的沉積物樣品作為研究對象,使用16S rRNA基因序列擴增子測序、qPCR以及熒光原位雜交三種方法對樣品中的慢生單胞菌目豐度進行分析。通過16S rRNA基因擴增子測序檢測,在所有鹽湖及鹽場的沉積物樣品中都檢測到了慢生單胞菌目的存在,共注釋出屬于慢生單胞菌目的91個OTU,其中文登鹽場沉積物中獨有的OTU有49個,運城鹽湖沉積物中獨有的OTU有15個,慢生單胞菌目在文登鹽場平均相對豐度為0.81%,在運城鹽湖所有沉積物樣品中的平均相對豐度為0.16%。通過qPCR對樣品中細菌16S rDNA序列... 

【文章頁數(shù)】：152 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞
第一章 緒論
    1.1 高鹽環(huán)境及其中的微生物
        1.1.1 高鹽環(huán)境及其分類
        1.1.2 高鹽環(huán)境中的微生物
        1.1.3 國內(nèi)外對高鹽環(huán)境微生物的研究
    1.2 環(huán)境中的微生物群落及其網(wǎng)絡分析
    1.3 慢生單胞菌目及其研究進展
    1.4 環(huán)境微生物的檢測方法
        1.4.1 培養(yǎng)方法檢測環(huán)境中的微生物
        1.4.2 熒光原位雜交技術
        1.4.3 高通量測序技術
        1.4.4 定量PCR (Quantitative-PCR)
    1.5 立題依據(jù)
第二章 慢生單胞菌目水平探針及引物的設計
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗樣品與菌株
        2.1.2 主要儀器與設備
        2.1.3 實驗試劑與耗材
        2.1.4 溶液與培養(yǎng)基配置
    2.2 實驗方法
        2.2.1 慢生單胞菌目特異性探針的設計及合成
        2.2.2 以探針序列為引物進行高通量測序驗證探針的可靠性
        2.2.3 實驗所用菌株的培養(yǎng)以及菌體收集
        2.2.4 純培養(yǎng)菌株熒光原位雜交
        2.2.5 探針熒光原位雜交最適條件的優(yōu)化
        2.2.6 驗證探針嚴謹性和覆蓋度的實驗
        2.2.7 慢生單胞菌目qPCR引物的設計與驗證
    2.3 實驗結果
        2.3.1 所設計探針及其覆蓋度
        2.3.2 以探針序列為引物進行高通量測序結果
        2.3.3 熒光原位雜交最適條件探究
        2.3.4 所設計探針嚴謹性和覆蓋度的純菌實驗
        2.3.5 慢生單胞菌目qPCR引物的設計與驗證
    2.4 本章小結
第三章 文登鹽場及運城鹽湖沉積物中慢生單胞菌目豐度檢測
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗材料
        3.1.2 主要儀器與設備
        3.1.3 實驗試劑與耗材
        3.1.4 溶液及培養(yǎng)基配置
    3.2 實驗方法
        3.2.1 沉積物樣品的固定及樣品DNA提取
        3.2.2 沉積物樣品PCR擴增、16S rRNA基因擴增子測序及分析
        3.2.3 熒光定量PCR分析
        3.2.4 沉積物樣品FISH試驗分析
    3.3 實驗結果
        3.3.1 16S rRNA基因擴增子測序慢生單胞菌目的豐度
        3.3.2 熒光定量PCR結果
        3.3.3 FISH檢驗結果
        3.3.4 慢生單胞菌豐度與環(huán)境因子之間的相關性分析
    3.4 本章小結與討論
第四章 文登鹽場和運城鹽湖細菌群落多樣性分析
    4.1 實驗材料
        4.1.1 采樣地點及樣品信息
        4.1.2 主要儀器與設備
    4.2 實驗方法
        4.2.1 樣品處理
        4.2.2 理化因子的測定
        4.2.3 16S rRNA基因擴增子測序及數(shù)據(jù)處理
        4.2.4 分子生態(tài)網(wǎng)絡構建及分析
    4.3 實驗結果與討論
        4.3.1 樣品的理化因子特征
        4.3.2 不同樣品中的物種組成及α-多樣性分析
        4.3.3 樣品之間共有OTU分析
        4.3.4 理化因子對樣品中細菌群落結構的影響
        4.3.5 水樣及沉積物樣品的分子生態(tài)網(wǎng)絡分析
    4.4 本章小結
第五章 兩株海洋新菌的多相分類研究
    5.1 實驗材料
        5.1.1 實驗所用菌株
        5.1.2 主要儀器與設備
        5.1.3 實驗試劑與耗材
        5.1.4 溶液及培養(yǎng)基的配置
    5.2 實驗方法
        5.2.1 16S rRNA基因序列分析
        5.2.2 基因組序列分析
        5.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析
        5.2.4 菌株表型和生理生化分析
        5.2.5 細菌化學組分測定
        5.2.6 菌種保藏
    5.3 實驗結果與分析
        5.3.1 檸檬色淤泥桿菌(Lutibacter citreus)1KV19~T的多相分類
        5.3.2 海濱革蘭氏菌(Gramella litoralis)KN1008~T的多相分類
    5.4 本章小結
第六章 總結與展望
    6.1 總結
    6.2 展望與不足
參考文獻
致謝
附錄
    附錄一 實驗所用主要儀器與設備
    附錄二 實驗所用主要試劑與耗材
    附錄三 實驗所用主要溶液及培養(yǎng)基的配置
    附錄四 部分實驗數(shù)據(jù)
資助情況
攻讀碩士學位期間發(fā)表的學位論文
學位論文評閱及答辯情況表



本文編號：3654657