水稻作為模式植物,利用雜交、回交、自交等傳統(tǒng)的育種方式對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行改良時(shí),具有操作復(fù)雜,耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)且不易獲得改良目標(biāo)性狀后的水稻植株。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)及分子標(biāo)記輔助選擇在水稻中得到了成功的運(yùn)用。抽穗期和株高作為水稻生育期中的主要農(nóng)藝性狀,決定著水稻的長(zhǎng)勢(shì)情況、適應(yīng)性以及高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)等。我們挑選了DTH8、Ghd7、SD1作為候選靶基因,使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定向改良了水稻抽穗期和株高性狀,構(gòu)建了它們的CRISPR/Cas9基因編輯表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法構(gòu)建這些載體在不同水稻材料中的突變體。本論文中,我們利用CRISPR/Cas9多靶點(diǎn)敲除技術(shù)敲除DTH8、Ghd7和SD1,獲得了具有粳稻品種香糯背景的dth8單突變體、ghd7單突變體和具有粳稻品種越光背景的sd1單突變體。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:根據(jù)候選靶基因設(shè)計(jì)靶位點(diǎn),將同一候選基因的兩個(gè)靶位點(diǎn)同時(shí)構(gòu)建到CRISPR/Cas9基因編輯表達(dá)載體中,CRISPR/Cas9表達(dá)載體包括單靶點(diǎn)雙元表達(dá)載體與雙靶點(diǎn)雙元表達(dá)載體;分別為CRISPR-DTH8-1、CRISPR-Ghd7-1和CRISPR-SD... 

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 目的基因研究進(jìn)展
        1.1.1 水稻SD1 基因的研究背景
        1.1.2 水稻抽穗期相關(guān)基因的研究背景
        1.1.3 水稻抗除草劑基因ALS的研究背景
        1.1.4 水稻蠟質(zhì)基因Wx-mq的研究背景
    1.2 基因編輯CRISPR/Cas9 概述
        1.2.1 基因編輯技術(shù)的種類
        1.2.2 CRISPR/Cas9 基因編輯原理
        1.2.3 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在水稻中的應(yīng)用
    1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系
    1.4 研究目的及意義
第二章 利用CRISPR/Cas9 技術(shù)改良粳稻品種香糯99-25 的抽穗期
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 用于基因編輯的水稻品種
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及藥品
        2.1.3 常用抗生素及培養(yǎng)基的配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 CRISPR/Cas9 敲除載體的構(gòu)建
        2.2.2 水稻組織培養(yǎng)試劑配制
        2.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化
        2.2.4 RNA的提取
        2.2.5 cDNA反轉(zhuǎn)錄
        2.2.6 基因編輯植株的鑒定與突變檢測(cè)
        2.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        2.2.8 突變體表型分析
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 CRISPR/Cas9 雙元載體的構(gòu)建
        2.3.2 基因編輯植株T_0 代的獲取及陽性植株鑒定結(jié)果
        2.3.3 CRISPR/Cas9 基因編輯植株的突變類型
        2.3.4 T_0 代基因編輯植株表型分析及RNA表達(dá)結(jié)果分析
        2.3.5 DTH8 不同突變材料對(duì)抽穗期的影響
    2.4 結(jié)論與討論
        2.4.1 DTH8和Ghd7 基因?qū)Τ樗肫诘挠绊?br>        2.4.2 抽穗期與日照長(zhǎng)短的探討
第三章 利用CRISPR/Cas9 技術(shù)改良粳稻品種越光的株高
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 用于基因編輯的水稻品種
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及藥品
        3.1.3 常用抗生素及培養(yǎng)基的配制
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 CRISPR/Cas9 敲除載體的構(gòu)建
        3.2.2 水稻組織培養(yǎng)試劑及常用培養(yǎng)基的制備
        3.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化
        3.2.4 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 CRISPR/Cas9 載體構(gòu)建
        3.3.2 CRISPR/Cas9 基因編輯植株T_0 代的獲取及陽性植株鑒定結(jié)果
    3.4 結(jié)論與討論
        3.4.1 CRISPR/Cas9 技術(shù)改良水稻的應(yīng)用性探討
        3.4.2 半矮桿主效基因SD1 的討論
第四章 利用分子標(biāo)記培育低直鏈淀粉含量抗除草劑水稻
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 水稻材料
        4.1.2 材料種植
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 引物合成與PCR檢測(cè)
        4.2.2 抗除草劑水稻植株的田間鑒定
        4.2.3 糯性基因外觀鑒定
        4.2.4 田間種植及農(nóng)藝性狀考察
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 雜交及回交轉(zhuǎn)育
        4.3.2 田間抗除草劑篩選
        4.3.3 糯性基因與抗除草劑基因的PCR檢測(cè)
        4.3.4 含糯性基因Wx-mq水稻胚乳外觀檢測(cè)
        4.3.5 田間農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量表現(xiàn)
    4.4 結(jié)論與討論
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄1 :本研究中所用引物
    附錄2 :各類培養(yǎng)基配方
    附錄3 :轉(zhuǎn)基因水稻煉苗時(shí)注意事項(xiàng)
碩士期間研究成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]利用基因編輯技術(shù)改良水稻性狀的研究進(jìn)展與展望[J]. 楊平,陳春蓮,熊運(yùn)華,黃永萍,姚曉云,尹建華.  江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2019(04)
[2]基于CRISPR/Cas9研究葉形相關(guān)基因NRL2對(duì)水稻抗旱性的影響[J]. 陳煒,邱牡丹,李潛龍,王建龍.  分子植物育種. 2018(22)
[3]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定向編輯水稻SD1基因[J]. 胡雪嬌,楊佳,程燦,周繼華,牛付安,王新其,張美良,曹黎明,儲(chǔ)黃偉.  中國(guó)水稻科學(xué). 2018(03)
[4]寧夏雜草稻外觀和碾磨品質(zhì)分析[J]. 馬靜,王興盛,段彩林,孫建昌.  種子. 2018(02)
[5]水稻抗咪唑啉酮類除草劑基因ALS功能標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用[J]. 王芳權(quán),楊杰,范方軍,李文奇,王軍,許揚(yáng),朱金燕,費(fèi)云燕,仲維功.  作物學(xué)報(bào). 2018(03)
[6]利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)獲得水稻OsYUCCA1基因突變體[J]. 何先暢,黃國(guó)強(qiáng),王道洋,常淑偉,張大兵.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2017(11)
[7]利用分子標(biāo)記輔助選擇聚合水稻Pi-ta、Pi-b和Wx-mq基因[J]. 姚姝,陳濤,張亞東,朱鎮(zhèn),趙慶勇,周麗慧,趙凌,趙春芳,王才林.  作物學(xué)報(bào). 2017(11)
[8]水稻抽穗期基因EHD8的遺傳分析及精細(xì)定位[J]. 李允振,黃永祿,謝旭陽,李志華,艾�；�,劉芳,邱永福,羅繼景,李容柏,覃寶祥.  中國(guó)科技論文. 2017(12)
[9]水稻半矮稈基因sd1功能標(biāo)記的開發(fā)與利用[J]. 徐建軍,張?jiān)戚x,顧嘯,姚麒麟.  上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2016(04)
[10]Genetic Improvement of Japonica Rice Variety Wuyujing 3 for Stripe Disease Resistance and Eating Quality by Pyramiding Stv-bi and Wx-mq[J]. CHEN Tao,WU Hao,ZHANG Ya-dong,ZHU Zhen,ZHAO Qi-yong,ZHOU Li-hui,YAO Shu,ZHAO Ling,YU Xin,ZHAO Chun-fang,WANG Cai-lin.  Rice Science. 2016(02)

博士論文
[1]轉(zhuǎn)錄因子DTH8抑制開花的分子機(jī)制及其在雜交水稻育種中的應(yīng)用[D]. 杜安平.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017

碩士論文
[1]利用CRISPR/Cas9技術(shù)改良水稻株高、抽穗期和品質(zhì)相關(guān)性狀的初步探討[D]. 王凱月.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018



本文編號(hào)：3651215