目的:通過(guò)建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,探究Ⅰ型（HSV1）和Ⅱ型（HSV2）基因產(chǎn)物對(duì)重組Ⅱ型單純皰疹病毒（o HSV2）復(fù)制的影響。方法:合成HSV1-ICP34.5和HSV2-ICP34.5基因序列,連接至Piggy Bac-Dual-promoter（PBDP）真核表達(dá)載體上,并通過(guò)測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)。將重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到Vero細(xì)胞和BHK細(xì)胞,構(gòu)建表達(dá)ICP34.5基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光蛋白（GFP,為穩(wěn)轉(zhuǎn)成功指示蛋白）的表達(dá),用PCR擴(kuò)增、實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫印染來(lái)鑒定ICP34.5目的基因及表達(dá)。再用穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系來(lái)生產(chǎn)o HSV2病毒,通過(guò)CCID50方法檢測(cè)病毒滴度來(lái)評(píng)估ICP34.5蛋白對(duì)o HSV2復(fù)制的影響。結(jié)果:共獲得4種穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,分別為VeroHSV1-ICP34.5、VeroHSV2-ICP34.5、BHKHSV1-ICP34.5和BHKHSV2-ICP34.5;4種新穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系于熒光顯微鏡下均能觀察到綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá),流式檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)到百分之九十以上;4種新穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系經(jīng)免疫印染檢測(cè)均能表達(dá)ICP34.5蛋白,用PCR... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物

湖北科技學(xué)院碩士學(xué)位論文173.實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1重組質(zhì)粒酶切鑒定及質(zhì)粒濃度測(cè)定圖1：重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物圖2：重組質(zhì)粒濃度測(cè)定將新構(gòu)建的重組質(zhì)粒PBDP-HSV1-ICP34.5和PBDP-HSV2-ICP34.5進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖1。從圖1可知，第二、第三、第四泳道都是重組質(zhì)粒PBDP-HSV1-ICP34.5樣品，三個(gè)泳道均出現(xiàn)目的條帶；第七、第八、第九泳道都是重組質(zhì)粒PBDP-HSV2-ICP34.5樣品，三個(gè)泳道均出現(xiàn)目的條帶。結(jié)果表明目的片段均成功插入真核表達(dá)載體PBDP。由其他生物公司幫助測(cè)序的結(jié)果表明，兩個(gè)構(gòu)建的新重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與HSV1-ICP34.5、HSV2-ICP34.5序列一致，表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒PBDP-HSV1-ICP34.5和PBDP-HSV2-ICP34.5。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒PBDP-HSV1-ICP34.5和PBDP-HSV2-ICP34.5各取15μl，分別與3μlLoadingBuffer混勻，再按5μl、4μl、3μl、2μl、1μl的濃度梯度加入到凝膠孔中，MarKer加5μl和10μl，電泳結(jié)束后，如圖2所示。由圖2可知，第二至第六泳道都為PBDP-HSV1-ICP34.5樣品，并且條帶亮度依次降低；第八至第十二泳道都為PBDP-HSV2-ICP34.5樣品，并且條帶亮度依次降低。根據(jù)與MarKer條帶對(duì)比，可以計(jì)算出PBDP-HSV1-ICP34.5重組質(zhì)粒濃度為80ng/μl，PBDP-HSV2-ICP34.5重組質(zhì)粒濃度為50ng/μl。

湖北科技學(xué)院碩士學(xué)位論文193.3PCR鑒定穩(wěn)定表達(dá)ICP34.5的Vero細(xì)胞系和BHK細(xì)胞系圖7：PCR鑒定表達(dá)ICP34.5的Vero細(xì)胞系圖8：PCR鑒定表達(dá)ICP34.5的BHK細(xì)胞系將6種細(xì)胞（Vero、VeroHSV1-ICP34.5、VeroHSV2-ICP34.5、BHKHSV1-ICP34.5、BHK和BHKHSV2-ICP34.5）從液氮罐中復(fù)蘇，分別傳代至T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%-90%時(shí)，用DNAzol試劑提取六種細(xì)胞的DNA，用PCR法鑒定細(xì)胞DNA中是否含有ICP34.5基因，結(jié)果如圖7，圖8所示。從圖7可知，VeroHSV1-ICP34.5和陽(yáng)性對(duì)照均出現(xiàn)目的條帶，大小為765bp，空白對(duì)照無(wú)條帶；VeroHSV2-ICP34.5和陽(yáng)性對(duì)照均出現(xiàn)目的條帶，大小為804bp，空白對(duì)照無(wú)條，故VeroHSV1-ICP34.5細(xì)胞和VeroHSV2-ICP34.5細(xì)胞中均含有目的基因。從圖8可知，BHKHSV1-ICP34.5和陽(yáng)性對(duì)照均出現(xiàn)目的條帶，大小為765bp，空白對(duì)照無(wú)條帶；BHKHSV2-ICP34.5和陽(yáng)性對(duì)照均出現(xiàn)目的條帶，大小為804bp，空白對(duì)照無(wú)條帶，故BHKHSV1-ICP34.5細(xì)胞和BHKHSV2-ICP34.5細(xì)胞中均含有目的基因。

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號(hào)：3602942