多重原位雜交技術(shù)能夠?qū)NA的表達(dá)豐度和空間位置進(jìn)行檢測,這為基因研究提供了新的思路。本文旨在開發(fā)一種基于鎖式探針的新型單分子RNA多重原位檢測技術(shù),擬解決目前多重原位檢測方法操作步驟繁瑣、基于逆轉(zhuǎn)錄的單分子RNA多重原位檢測效率低下以及可用光譜分辨的熒光染料的數(shù)量有限等問題。首先,我們對(duì)新型單分子RNA多重原位檢測在乳腺癌細(xì)胞中的不同mRNA原位檢測進(jìn)行了探索。對(duì)應(yīng)用于多重原位檢測的新型鎖式探針的設(shè)計(jì)進(jìn)行了嘗試,與以往探針不同的是我們通過在鎖式探針上的三個(gè)位置插入條形碼DNA片段,每個(gè)序列對(duì)應(yīng)一個(gè)獨(dú)特的熒光標(biāo)記檢測探針,通過在三輪檢測之后,理論上可以對(duì)于64種基因進(jìn)行多重檢測;其次,我們?cè)赟K-BR-3、MDA-MB-231和T-47D這3種乳腺癌細(xì)胞系上對(duì)相關(guān)基因如HER2、ESR1、PGR及MKI67等完成了多達(dá)39種基因的多重檢測,其結(jié)果顯示,ESR1和PGR這兩個(gè)基因在T-47D上的信號(hào)檢出量最高,而HER2和MKI67這兩個(gè)基因則分別在SK-BR-3和MDA-MB-231上有最高的信號(hào)檢出量,結(jié)果和人類蛋白質(zhì)圖譜計(jì)劃中的結(jié)果一致。此外,我們將SK-BR-3和T-47D中待測... 

【文章來源】：華僑大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：110 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

原位測序原理圖（引自KeR等）

第1章緒論7組合標(biāo)簽、連續(xù)成像等技術(shù)來提高檢測通量，還通過error-robust編碼方案，來抵消單分子標(biāo)記和檢測錯(cuò)誤。研究人員用MERFISH技術(shù)對(duì)數(shù)百個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了分析，可在單細(xì)胞中同時(shí)成像100-1000種RNA。他們還通過相關(guān)分析繪制了基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測了基因功能，鑒定了與蛋白屬性有關(guān)的RNA分布模式[39]。但是，MERFISH產(chǎn)生的單個(gè)RNA分子的信號(hào)的亮度在應(yīng)用時(shí)可能會(huì)受到限制，例如增加成像通量，成像較短的RNA和對(duì)背景度較高的組織樣品進(jìn)行成像[40]。ChenglongXia等人開發(fā)了一種MERFISH和分支DNA（branchDNA,bDNA）結(jié)合的方法[40]。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)方案（圖1.2），首先將編碼探針結(jié)合到MERFISH樣本上，然后再結(jié)合一組初級(jí)擴(kuò)增子寡核苷酸探針，其中每組初級(jí)擴(kuò)增子寡核苷酸探針包括一個(gè)與讀出序列互補(bǔ)的初級(jí)擴(kuò)增子以及一個(gè)20-mer重復(fù)的簡并核苷酸探針；然后將一組次級(jí)擴(kuò)增子寡核苷酸添加到樣品中。每組次級(jí)擴(kuò)增子都靶向一個(gè)相應(yīng)的初級(jí)擴(kuò)增子上的結(jié)合位點(diǎn)，并包含另一個(gè)獨(dú)特的20-mer的重復(fù)簡并核苷酸；最后將次級(jí)放大器上結(jié)合位點(diǎn)的熒光標(biāo)記探針與樣品雜交。以這種方式，每個(gè)原始的讀出序列將被擴(kuò)增成另一個(gè)結(jié)合序列的N2個(gè)拷貝，從而允許結(jié)合N2個(gè)熒光探針。最終可以在不增加光斑尺寸的情況下將光斑亮度增加一個(gè)數(shù)量級(jí)以上，并且它們不會(huì)增加光斑亮度的可變性。bDNA擴(kuò)增與MERFISH的結(jié)合將促進(jìn)許多其他應(yīng)用，并擴(kuò)大該技術(shù)在細(xì)胞培養(yǎng)和組織中解決生物學(xué)問題的范圍。圖1.3MERFISH成像的bDNA擴(kuò)增示意圖（引自ChenglongXia等）（a）MERFISH編碼探針片段（b）初級(jí)擴(kuò)增子結(jié)合示意圖（c）次級(jí)擴(kuò)增子介示意圖

不同基因進(jìn)行不同顏色的檢測探針直接檢測，實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)幾十個(gè)基因進(jìn)行原位檢測。StenLinnarsson等人提出的環(huán)形單分子熒光原位雜交技術(shù)（cyclic-ouroborossmFISHmethod,osmFISH）則采取了在每一輪反應(yīng)中只檢測有限的幾個(gè)基因，圖像采集完畢后，用甲酰胺去除探針進(jìn)行下一輪雜交，最后經(jīng)過多輪的雜交定義了體感皮層的細(xì)胞組織（圖1.4）。osmFISH檢測的目標(biāo)基因數(shù)目由熒光通道數(shù)和雜交數(shù)輪數(shù)決定。并且由于不使用條碼序列，因此可以分別對(duì)每個(gè)圖像進(jìn)行全面分析，并且高表達(dá)基因（光斑重疊難以分辨）不會(huì)影響低表達(dá)基因的檢測。圖1.4osmFISH原理示意圖（引自StenLinnarsson等）1.3本課題選題背景及預(yù)期1.3.1本課題選題背景精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的出現(xiàn)使得對(duì)單個(gè)腫瘤進(jìn)行分子鑒定成為可能，從而能夠?yàn)槊课换颊吡可矶ㄖ浦委煼桨浮Ｈ欢�，腫瘤異質(zhì)性使精準(zhǔn)治療難以進(jìn)行，因?yàn)樵谕荒[瘤中可能存在具有不同治療敏感性和/或表型特征的多個(gè)亞克隆[48]，因此使得醫(yī)生在選擇特定治療方法時(shí)變得更加困難。此外，腫瘤異質(zhì)性的研究也需要空間分辨技術(shù)的技術(shù)，這種技術(shù)能夠深入研究腫瘤組織內(nèi)不同細(xì)胞生態(tài)環(huán)境及其信號(hào)通路，以此來揭示有關(guān)其調(diào)控生物學(xué)的信息。當(dāng)前乳腺癌診斷依靠組織病理學(xué)的綜合評(píng)估，包括腫瘤分級(jí)和ER，PR，HER2（與ISH/FISH結(jié)合）以及KI67的免疫組織化學(xué)染色�；�?qū)|(zhì)化組織的大細(xì)胞裂解物進(jìn)行互補(bǔ)分子分析，例如下一代測序，Mammaprint[49]，OncotypeDX復(fù)發(fā)評(píng)分[50]和PAM50[51]。乳腺癌在腫瘤內(nèi)和腫瘤間均表現(xiàn)出異質(zhì)性，具有數(shù)千種不同的突變和在每個(gè)腫瘤中獨(dú)特的數(shù)個(gè)拷貝數(shù)變異，以及具有不同基因組改變的亞克隆變異。在乳腺癌中經(jīng)常觀察到腫瘤內(nèi)ER[52]和KI67[53]表達(dá)的異質(zhì)性，在HER2陽性乳腺癌中也觀察


本文編號(hào)：3572135