為高效生產(chǎn)特異性抗體,利用已知基因序列設(shè)計好的引物RT-PCR直接擴增出了隆線溞Daphnia carinata和老年低額溞Simocephalus vetulus幾丁質(zhì)酶（chitinase,EC 3.2.1.14）基因序列全長（隆線溞1149bp,老年低額溞1086bp）。然后通過雙酶切幾丁質(zhì)酶基因和pCold表達載體并將兩者連接,構(gòu)建出重組表達載體。重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后得到了兩種生物的重組幾丁質(zhì)酶蛋白。將重組幾丁質(zhì)酶蛋白經(jīng)過純化處理后作為抗原,免疫新西蘭白兔,最終分別得到效價約1:158000和1:134000的兔抗重組隆線溞和老年低額溞幾丁質(zhì)酶多克隆抗體。應(yīng)用間接非競爭ELISA方法對于抗原抗體最適反應(yīng)濃度進行了測量。其中,隆線溞幾丁質(zhì)酶抗體的最適稀釋倍數(shù)為1:16000(濃度4.75×10^-5mg·mL^-1),測定重組幾丁質(zhì)酶的標準曲線為y=1.4711×(1-e^-1.5431x)(R=0.9892,S=0.0915,最低檢測限24.1 ng·mL^-1);老年... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：90 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

隆線溞

老年低額溞

浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文緒論71.2.3中華薄殼介中華薄殼介，分類為動物界Animalia、節(jié)肢動物門Arthropoda、甲殼綱Crustacea、介形亞綱Ostracoda、速足目Podocopida、腺狀介蟲科Cyprididae、薄殼介屬Dolerocypris，殼薄而透明，呈淡綠色或淡棕綠色。側(cè)面觀呈覆舟狀，背緣中部最高，向兩端緩緩傾斜，腹緣直；背面觀呈紡錘形，狹長，兩端尖。介形蟲類（Ostracode）作為地球上最古老的的生物之一（Schnetal.,2016），一直延續(xù)至今，在水體、陸地上均有分布（禹娜，2005），過去主要應(yīng)用于地質(zhì)學(xué)研究中，在生物學(xué)領(lǐng)域的研究甚少，但作為一類新興的實驗動物，正逐漸受到人們的關(guān)注（Niyommaneeratetal.,2017）。圖1.5中華薄殼介1.3抗原和抗體的制備1.3.1抗原的制備為獲得能夠特異性識別某個物種的幾丁質(zhì)酶抗體，需要先根據(jù)目標物種提取出抗原蛋白，根據(jù)現(xiàn)有的研究，有三種獲得抗原的方法可供選擇。（1）直接從目標生物體內(nèi)提取出酶，經(jīng)過純化后將電泳純的酶作為抗原。此方法優(yōu)勢在于獲取酶源容易，但缺點是分離純化的過程繁瑣，對酶的純度要求很高，且每次制備抗體時都需要重新提取酶，工作量大；（2）根據(jù)目標酶已知的基因序列通過序列比對后挑選特異性序列合成多肽作為抗原。多肽蛋白序列較短，生產(chǎn)效率高，能通過NCBI中公開的物種基因序列和蛋白序列，篩選出特異性較高的序列，減少相


本文編號：3549949