豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病病毒（PRRSV）引起的一種病毒性傳染病,它能引起母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、畸形胎及仔豬、育肥豬呼吸道等癥狀。自1995年P(guān)RRS傳入中國至今已有25年,2001年后該病開始頻繁發(fā)生。尤其近幾年由于我國PRRSV頻繁發(fā)生變異,導(dǎo)致PRRSV毒株復(fù)雜多樣,這使得PRRS的防控工作增加了巨大的難度。本研究為了解山東及周邊地區(qū)PRRSV的流行及變異情況,對本實驗室自2013年保存的2000份疑似陽性病料,利用RT-PCR方法進(jìn)行檢測并對確定為陽性樣品進(jìn)行病毒分離與鑒定,結(jié)果分離到20株P(guān)RRSV。將分離的20株P(guān)RRSV進(jìn)行RNA提取并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,利用12對PRRSV全長引物進(jìn)行全基因組DNA序列擴(kuò)增、測序和序列拼接,將拼接完成的基因序列同國內(nèi)外GenBank中代表性的PRRSV參考毒株比對,從而進(jìn)行基因序列同源性、系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹、部分NSP2和ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸關(guān)鍵位點(diǎn)及重組毒株分析。分析結(jié)果顯示,本研究分離20株P(guān)RRSV在基因系統(tǒng)進(jìn)化樹上形成了三個大分支,即譜系8/亞系8.1（CH-1a-like）、譜系8/亞系8.7（JX... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

PRRSV粒子示意圖（田克恭，2015）

’端為非翻譯區(qū)(UTR)和ploy（A）尾序列，歐洲型和美洲型之間序列同源性僅為76%(劉光清等，2002)。中間包括相互重疊的10個開放閱讀框（ORF），分別為ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5a、ORF5、ORF6、ORF7(Conzelmannetal.,1993;Meulenbergetal.,1993)，每個開放閱讀框編碼特異性病毒蛋白，參與病毒的復(fù)制。其中ORF1約占全長的80%，長度約10~12kb,ORF1a、ORF1b分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1α、NSP1β、NSP2~NSP9和NSP8~NSP12。ORF2a~ORF7分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白GP2a、E、GP3、GP4、GP5a、GP5、M、N。PRRSV基因組結(jié)構(gòu)如圖2圖2PRRSV基因組結(jié)構(gòu)示意圖(BrarMS.etal.，2015)Fig.2StructuralDiagramofPRRSVgenome(BrarMS,etal.，2015)1.2.3PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白及功能ORF1a和ORF1b為非結(jié)構(gòu)蛋白開放閱讀框，編碼復(fù)制酶和聚合蛋白，約占全基因組的三分之二,共編碼13個非結(jié)構(gòu)蛋白(SnijderEJetal.,2001)，分別為NSP1α、NSP1β、NSP2~12，參與PRRSV的復(fù)制，非結(jié)構(gòu)蛋白基因也是整個病毒基因組中變異最大的基因（Forsbergetal.,2001；Songetal.,2012）。NSP1α和NSP1β是一種復(fù)制酶非結(jié)構(gòu)蛋白，兩者都具有木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶活性的區(qū)域，它們是從ppla和pplab多聚蛋白上切割下來的（Ziebuhretal.,2000）。NSP1α由180個氨基酸組成，大小19kDa，以二聚體的形式存在,而NSP1β含有203個氨基酸，大小為23kDa的多肽（Plagemann,2004）。相關(guān)研究表明NSP1α在病毒轉(zhuǎn)錄過程中起著重要作用，它能抑制干擾素的產(chǎn)生，使病毒對細(xì)胞的感染性增強(qiáng)。非結(jié)構(gòu)蛋白NSP2是ORF1a中最大的蛋白，也是不同毒株之間基因型差別最大的區(qū)域，NSP2在自

山東省及周邊地區(qū)2013-2018年豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組遺傳進(jìn)化分析20圖3-1分離毒株N基因檢測結(jié)果Fig3-1IsolatePRRSVNgenetestresults注：M:DL2000DNAMarker1:ANSZ-p9-20132：SDLY-p6-20133：SDYT-p13-20134：SDLY-p11-20135：SDLY-p14-20136：ANSZ-p10-20137：SDWF-p8-3-20148：SDLC-23-2015:9：SDRZ-10-12-201510：SDTA-CM-201511：SDGM-7-3-201612：SDDP-31-201613：ANSZ-32-201614：HBHD-201715：SDJY-201716：SDTA-MZ-201717：SDJN-LH-201718：SDHZ-201719：SDTA-MM-201820：SDLC-CP-201821：陰性對照3.1.2病毒分離結(jié)果PRRSV陽性樣品接種Marc-145細(xì)胞,于36h、48h觀察細(xì)胞病變，36h時開始出現(xiàn)輕微病變，48h時細(xì)胞開始出現(xiàn)圓縮聚集成團(tuán)，折光性增強(qiáng)現(xiàn)象，繼續(xù)培養(yǎng)至60~72h，觀察到細(xì)胞開始脫落、裂解甚至死亡現(xiàn)象；對照組細(xì)胞始終未出現(xiàn)病變，不同毒株出現(xiàn)病變的程度不同。分離PRRSV在Marc-145細(xì)胞的60hCPE，結(jié)果說明分離到了能使Marc-145細(xì)胞發(fā)生病變的PRRSV。如圖3-2。圖3-2分離毒株對Marc-145細(xì)胞引起的病變結(jié)果Fig3-2CPEcausedbystrainsPRRSVonMarc-145cells注：A為陽性對照TA-12（100x）B為本研究分離代表毒株SDJY-2017（100x）C為陰性對照（100x）3.1.3病毒的鑒定通過間接免疫熒光（IFA）的方法，將分離的PRRSV接種在Marc-145細(xì)胞上進(jìn)行IFA鑒定，結(jié)果顯示Marc-145細(xì)胞中有PRRSV的增殖，證明成功分離到PRRSV。如M192021

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3481274