家蠶（Bombyx mori L.）,屬完全變態(tài)的鱗翅目昆蟲,是目前最重要的經(jīng)濟昆蟲之一。養(yǎng)蠶繅絲的發(fā)明是中國人民對世界文明作出的卓越貢獻。近年來,中國蠶絲產(chǎn)業(yè)形勢愈加嚴峻,家蠶品種改良可促進我國蠶絲產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,很好的緩解這種嚴峻形勢。從馴化的角度來說,家蠶在人工選擇下眾多經(jīng)濟性狀及性能相較于其野生祖先野桑蠶發(fā)生了顯著的提升。揭示家蠶和野桑蠶之間生物學差異的遺傳基礎,不僅能夠探究家蠶的馴化機制,還能夠發(fā)現(xiàn)家蠶吐絲能力增強的一些線索�；蚪M測序和大數(shù)據(jù)的興起以及基因編輯技術(shù),尤其是CRISPR/Cas9技術(shù)的快速發(fā)展使得我們能夠更容易的進行基因編輯,研究家蠶中某些基因的生物學功能。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在家蠶多化地方品系nistari中敲除絲蛋白基因（絲素重鏈基因和P25基因）和6個人工選擇信號較強的馴化基因（BGIBMGA011266-TA（儲存蛋白）、BGIBMGA014418-TA（鋅指蛋白）、BGIBMGA000221-TA（隱花色素 1）、BGIBMGA007789-TA（隱花色素 2）。BGIBMGA012700-TA（谷氨酸合成酶）、BGIBMGA01... 

【文章來源】：昆明理工大學云南省

【文章頁數(shù)】：100 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 家蠶文獻綜述
    1.1 絲綢行業(yè)現(xiàn)狀
    1.2 蠶桑業(yè)現(xiàn)狀
    1.3 家蠶生物反應器研究進展和面臨的瓶頸
    1.4 對家蠶馴化基因研究的必要性和有利條件
    1.5 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展
    1.6 應用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除的備選基因
第二章 敲除絲素重鏈探究絲膠繭形成機制
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 CRISPR/Cas9敲除的方法及突變體的獲得
        2.2.2 突變體轉(zhuǎn)錄組分析
    2.3 結(jié)果分析
        2.3.1 絲素重鏈基因閱讀框移碼突變突變體獲得
        2.3.2 轉(zhuǎn)錄組分析
    2.4 討論
第三章 利用CRISPR/Cas9敲除家蠶存儲蛋白1基因揭示其在蠶卵孵化中的重要作用
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 材料
        3.2.2 構(gòu)建部分鱗翅目昆蟲儲存蛋白進化樹
        3.2.3 sgRNA設計及合成
        3.2.4 sgRNA體外轉(zhuǎn)錄
        3.2.5 Cas9質(zhì)粒線性化
        2.2.6 Cas9 mRNA體外轉(zhuǎn)錄
        2.2.7 顯微注射實驗前準備
        2.2.8 注射卵的制備
        3.2.9 顯微注射預實驗
        3.2.10 顯微注射
        3.2.11 突變體篩選
        3.2.12 純合突變體編碼蛋白預測
        3.2.13 RNA提取
        3.2.14 cDNA轉(zhuǎn)錄
        3.2.15 qPCR分析
        3.2.16 純合突變體表型觀察及統(tǒng)計
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 確定BmSp1屬于蛋氨酸富集儲存蛋白
        3.3.2 sgRNA位點設計和BmSp1突變類型
        3.3.3 篩選純合突變體和突變體編碼蛋白預測
        3.3.4 BmSp1基因在突變體脂肪體中表達情況
        3.3.5 突變引起孵化率顯著降低,但是不影響繭重和蛹重
    3.4 討論
第四章 P25以及馴化相關(guān)基因在多化地方品系nistari中的敲除以及后續(xù)分析
    4.1 基因信息
    4.2 材料與方法
        4.2.1 材料
        4.2.2 sgRNA設計及合成
        4.2.3 sgRNA體外轉(zhuǎn)錄
        4.2.4 Cas9質(zhì)粒線性化
        4.2.5 Cas9 mRNA體外轉(zhuǎn)錄
        4.2.6 顯微注射實驗前準備
        4.2.7 注射卵的制備
        4.2.8 顯微注射預實驗
        4.2.9 顯微注射
        4.2.10 突變體篩選
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 敲除P25基因?qū)е峦陆z量減少,但是不影響正常吐絲
        4.3.2 敲除鋅指蛋白幼蟲死亡率增加,蛹期呈現(xiàn)多態(tài)性
        4.3.3 在馴化過程受到人工選擇的氨基酸代謝通路相關(guān)基因敲除
        4.3.4 節(jié)律基因的敲除
    4.4 討論
第五章 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在云南本地實用品系中的可行性探索
    5.1 基因信息
    5.2 材料與方法
        5.2.1 材料
        5.2.2 sgRNA設計及合成
        5.2.3 sgRNA體外轉(zhuǎn)錄
        5.2.4 Cas9質(zhì)粒線性化
        5.2.5 Cas9 mRNA體外轉(zhuǎn)錄
        5.2.6 顯微注射實驗前準備
        5.2.7 注射卵的制備
        5.2.8 顯微注射預實驗
        5.2.9 顯微注射
        5.2.10 突變體檢測
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 P25基因敲除后代滯育后目前沒有孵化
        5.3.2 BGIBMGA000612-TA, BGIBMGA000648-TA, BGIBMGA006831-TA6,BGIBMGA000601-TA突變檢測
    5.4 討論
第六章 總結(jié)和展望
致謝
參考文獻
附錄A 攻讀學位期間發(fā)表及待發(fā)表論文
附錄B 攻讀學位期間申請專利


【參考文獻】：
期刊論文
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[4]CRISPR-Cas9驅(qū)動的基因編輯新紀元[J]. 熊彬彬,曾虎,劉云坤,孫宇輝.  微生物學通報. 2017(01)
[5]東桑西移與北桑南移——蠶桑產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)移動因分析[J]. 熊超,胡興明.  中國蠶業(yè). 2015(01)
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[9]重振蠶桑絲綢之雄風[J]. 胡祚忠,肖金樹,葉晶晶,吳建梅,張劍飛.  絲綢. 2011(11)
[10]piggyBac轉(zhuǎn)座子介導的轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺生物反應器研究進展[J]. 鐘伯雄,危浩,莊蘭芳.  中國農(nóng)業(yè)科學. 2011(21)

博士論文
[1]基于基因組編輯的家蠶絲腺遺傳改良與應用研究[D]. 馬三垣.西南大學 2014



本文編號：3474138