發(fā)布時(shí)間：2017-05-02 22:17

  本文關(guān)鍵詞：青島文昌魚（Branchiostoma japonicum）viperin表達(dá)和功能特性，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：Viperin是一種已被熟知的抗病毒蛋白,它會(huì)被類型Ⅰ、類型Ⅱ和類型Ⅲ干擾素,一些DNA和RNA病毒,LPS,poly(I:C)強(qiáng)烈誘導(dǎo)。Viperin包含3個(gè)功能域,分別為具有兩親性α螺旋結(jié)構(gòu)的多變N-端,包含有Cx3Cx2C結(jié)構(gòu)的中間區(qū)域和非常保守的C-端。其中N-端對于viperin的亞細(xì)胞定位非常重要,中間區(qū)域的Cx3Cx2C結(jié)構(gòu)為radical-SAM酶的特有結(jié)構(gòu),可以參與[4Fe-4S]簇的形成,介導(dǎo)一系列的氧化還原反應(yīng),而保守的C-端最近已經(jīng)被證實(shí)對于抗病毒功能是至關(guān)重要�，F(xiàn)已知,viperin存在于從魚類到哺乳動(dòng)物的一些物種中,而在文昌魚中viperin的相關(guān)信息還未有報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中,我們通過PCR,RACE技術(shù)克隆得到一條可能是青島文昌魚viperin的基因,它的長度為1540bp,其中開放閱讀框(ORF)部分為1074bp,5’非翻譯區(qū)為71bp,而3’非翻譯區(qū)為395bp。通過該基因與人,黑猩猩,小鼠等12個(gè)物種進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn)在青島文昌魚中該基因與其他物種的viperin基因相似度為60.7%-87.8%,且該基因的N-端同樣多變,而中間區(qū)域和C-端則非常保守。而后對該基因的結(jié)構(gòu)分析我們發(fā)現(xiàn),該基因與其他物種的viperin基因一樣,同樣包含四個(gè)保守的模序,其中模序1含有Cx3Cx2C結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明該基因編碼的蛋白含有Elp3結(jié)構(gòu)域,屬于MoaA超家族,有radical-SAM酶的活性。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測則表明該基因編碼的蛋白與其他物種中的viperin蛋白有非常相似的三級結(jié)構(gòu)。這些都表明我們所獲得的基因正是viperin基因,因此我們將它命名為Bjvip。之后我們對viperin基因在3種文昌魚和24種魚的進(jìn)化選擇壓力分析表明,在位點(diǎn)模型中,viperin基因在進(jìn)化中存在正向選擇的位點(diǎn),且這些位點(diǎn)都位于N-端。而在支-特異模型中,二比率模型并未篩選出受到正向選擇壓力的支系。共線性分析表明在所分析的除鴨嘴獸外的脊索動(dòng)物中,viperin (RSAD2)總會(huì)與CMPK2連接在一起,這表明CMPK2-RSAD2的連接在脊索動(dòng)物的進(jìn)化中是高度保守的。通過對viperin基因在青島文昌魚中的表達(dá)模式分析我們發(fā)現(xiàn)Bjvip主要在肝盲囊,肌肉,鰓,后腸中表達(dá),而在卵巢,脊索,精巢中少量表達(dá)。這表明viperin在青島文昌魚中的表達(dá)有組織特異性。而通過poly (I:C)刺激青島文昌魚后我們發(fā)現(xiàn),Bjvip在所有檢測的組織(肝盲囊,肌肉,鰓,后腸)中表達(dá)量均明顯升高,表明poly(I:C)的刺激可以誘導(dǎo)Bjvip的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證BjVip蛋白是否也同樣具有抗病毒功能,在體外實(shí)驗(yàn)中,通過構(gòu)建真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染入FG細(xì)胞后,用LCDV病毒感染細(xì)胞,并通過qRT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)病毒的相對數(shù)量,結(jié)果顯示,在病毒感染48h和72h時(shí),轉(zhuǎn)染目的蛋白組病毒相對數(shù)量明顯比轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組病毒相對數(shù)量要低。表明BjVip蛋白可以對抗LCDV病毒的復(fù)制。而在體內(nèi)試驗(yàn)中,通過構(gòu)建原核表達(dá)載體表達(dá)并驗(yàn)證rBjVip蛋白后與WSSV呼育并注射入蝦體中,結(jié)果顯示,在注射后8到24h,rBjVip蛋白可以顯著的降低蝦中肌肉和肝胰腺組織中的WSSV病毒的數(shù)量,表明rBjVip蛋白具有抗WSSV病毒的功能。
【關(guān)鍵詞】：青島文昌魚 viperin 抗病毒 正向選擇
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;Q51
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第一章 引言13-22
• 1. Viperin13-19
• 1.1 Viperin的發(fā)現(xiàn)13-14
• 1.2 Viperin的結(jié)構(gòu)及其功能14-15
• 1.3 Viperin的亞細(xì)胞定位15
• 1.4 Viperin的誘導(dǎo)表達(dá)15-16
• 1.5 RNase MRP對viperin表達(dá)的調(diào)控16
• 1.6 Viperin表達(dá)沉默16-17
• 1.7 Viperin的生物學(xué)功能17-19
• 2. 文昌魚19-21
• 2.1 文昌魚的形態(tài)結(jié)構(gòu)19
• 2.2 文昌魚的生活習(xí)性與分布19-20
• 2.3 文昌魚的進(jìn)化地位20-21
• 3. 研究的目的、意義及技術(shù)路線21-22
• 3.1 研究目的和意義21
• 3.2 技術(shù)路線21-22
• 第二章 青島文昌魚(Branchiostoma japonicum)viperin表達(dá)和功能特性22-67
• 1. 前言22
• 2. 材料與方法22-52
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料22-25
• 2.1.1 文昌魚22
• 2.1.2 南美白對蝦22-23
• 2.1.3 牙鲆鰓細(xì)胞(FG)23
• 2.1.4 對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)與淋巴囊腫病毒(LCDV-cn)23
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)試劑23
• 2.1.6 實(shí)驗(yàn)儀器23-24
• 2.1.7 菌株與質(zhì)粒24
• 2.1.8 DNA測序及引物合成24-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法25-52
• 2.2.1 性成熟青島文昌魚的總RNA提取及cDNA合成25-27
• 2.2.2 青島文昌魚viperin基因中間片段的克隆27-31
• 2.2.3 青島文昌魚viperin基因5’序列的克隆31-33
• 2.2.4 青島文昌魚viperin基因3’序列的克隆33-35
• 2.2.5 構(gòu)建包含全長序列信息的質(zhì)粒35-36
• 2.2.6 青島文昌魚viperin基因序列分析36-37
• 2.2.7 Bjvip表達(dá)組織分布研究與poly(I：C)刺激表達(dá)情況的研究37-39
• 2.2.8 BjVip成熟蛋白的原核表達(dá)39-47
• 2.2.9 rBjVip蛋白抗病毒功能的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)47-49
• 2.2.10 BjVip蛋白抗病毒功能的體外試驗(yàn)49-52
• 3. 結(jié)果52-64
• 3.1 青島文昌魚RNA的提取以及cDNA的合成52
• 3.2 青島文昌魚viperin基因中間片段的克隆52-53
• 3.3 青島文昌魚viperin基因全長的克隆53-54
• 3.4 青島文昌魚viperin基因的生物信息學(xué)分析54-60
• 3.4.1 結(jié)構(gòu)分析54-56
• 3.4.2 青島文昌魚viperin的進(jìn)化分析56-60
• 3.5 Bjvip水平組織分布60
• 3.6 Poly(I：C)刺激青島文昌魚檢測Bjvip的表達(dá)情況60-61
• 3.7 青島文昌魚viperin基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建,蛋白表達(dá)與純化61-62
• 3.8 原核表達(dá)重組蛋白的體內(nèi)抗病毒功能62-63
• 3.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和體外抗病毒功能實(shí)驗(yàn)63-64
• 4. 討論64-67
• 參考文獻(xiàn)67-72
• 致謝72-73
• 個(gè)人簡歷73

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本文編號：341812