本文關(guān)鍵詞：產(chǎn)漆酶茶葉內(nèi)生真菌的篩選、酶的分離純化及酶學(xué)特性的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：漆酶是一類含銅多酚氧化酶,催化氧化不同種類型的底物已達(dá)200余種,廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、廢水處理、造紙工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。本論文是從茶葉內(nèi)生真菌篩選產(chǎn)漆酶的菌株,分析不同營養(yǎng)因素和培養(yǎng)條件對真菌產(chǎn)漆酶的影響,并優(yōu)化培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件；在此基礎(chǔ)上,分離純化漆酶,分析粗酶液對茶多酚的生物轉(zhuǎn)化效果。采用6種顯色底物的平板初篩和酶活性測定的復(fù)篩方法,從15株茶葉內(nèi)生真菌菌株中篩選獲得1株產(chǎn)漆酶酶活較高的菌株CSN-4。分析不同營養(yǎng)因素和培養(yǎng)條件對菌株漆酶酶活力的影響,以及培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn),獲得到菌株CSN-4最適液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：麩皮30.0 g/L、蛋白胨2.25 g/L、KH2PO4 2.0 g/L、MgSO4 ·7H2O 0.2 g/L、MnSO4 ·5H2O 0.5 g/L、 CuSO4·5H2O 0.0175 g/L、茶水6g/L。最佳的發(fā)酵條件為：接種量為6個(gè)菌餅(直徑為6 mm),裝液量60 mL/250 mL,pH(4.8)自然,轉(zhuǎn)速120 r/min,溫度28℃。通過硫酸銨沉淀、DEAE-纖維素陰離子層析和葡聚糖G-150凝膠層析等方法分離純化漆酶,純化倍數(shù)為8.98,回收率為24.88%,漆酶相對分子質(zhì)量約為70 kDa。對純化后的漆酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,漆酶的最適溫度為60℃,最適pH 4.0,漆酶在35℃以下保溫1h,仍能保存95%以上的酶活,在溫度大于50℃保溫1h,剩余酶活在60%以下,該漆酶在高溫條件下,熱穩(wěn)定性比較差。漆酶在25℃條件下pH4-6保持4 h,酶活保持在96%以上,在pH大于8條件下保持4h,剩余酶活在26%以下,此漆酶在酸性條件下更穩(wěn)定。低濃度Cu2+對漆酶酶活有促進(jìn)作用,當(dāng)Cu2+濃度大于5 mmol/L時(shí),對漆酶具有一定抑制作用。初步研究了漆酶對茶多酚的轉(zhuǎn)化效果,分光光度計(jì)法和HPLC檢測的結(jié)果顯示,漆酶粗酶液對茶多酚溶液轉(zhuǎn)化效果明顯,轉(zhuǎn)化后兒茶素EC、ECG這兩種物質(zhì)含量下降,分別下降了17.28%和28.6%,而EGCG這種物質(zhì)的含量明顯變多,增加量達(dá)到81.04%。平板篩選得到產(chǎn)漆酶的內(nèi)生真菌CSN-4,經(jīng)過培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化后,漆酶酶活提高了約24倍。菌株CSN-4液體發(fā)酵產(chǎn)生的漆酶能使茶多酚溶液發(fā)生轉(zhuǎn)化。
【關(guān)鍵詞】：茶葉 內(nèi)生真菌 漆酶 培養(yǎng)條件 發(fā)酵優(yōu)化 分離純化 酶學(xué)性質(zhì) 茶多酚
【學(xué)位授予單位】：福建師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q936
【目錄】：

• 中文摘要2-3
• Abstract3-5
• 中文文摘5-12
• 第一章 緒論12-26
• 1 茶葉概述12
• 1.1 中國茶葉資源現(xiàn)狀12
• 1.2 茶葉的生物活性成分12
• 2 植物內(nèi)生真菌12-13
• 2.1 內(nèi)生真菌的多樣性12-13
• 2.2 內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的多樣性13
• 3 漆酶概述13-19
• 3.1 漆酶的介紹13-14
• 3.2 漆酶的來源14-17
• 3.3 漆酶的發(fā)酵生產(chǎn)17-18
• 3.4 漆酶酶活測定18
• 3.5 漆酶的分離純化18-19
• 4 漆酶的應(yīng)用19-21
• 4.1 環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用19
• 4.2 工業(yè)中的應(yīng)用19-20
• 4.3 食品工業(yè)中的應(yīng)用20
• 4.4 生物檢測中的應(yīng)用20
• 4.5 醫(yī)藥中的應(yīng)用20
• 4.6 對茶多酚轉(zhuǎn)化的應(yīng)用20-21
• 5 茶多酚的介紹21-22
• 6 本課題研究的內(nèi)容和意義22-26
• 6.1 主要內(nèi)容及技術(shù)路線22-23
• 6.2 研究意義23-26
• 第二章 產(chǎn)漆酶茶葉內(nèi)生真菌的篩選26-34
• 1 前言26
• 2 材料與方法26-32
• 2.1 材料26-27
• 2.1.1 供試菌株26
• 2.1.2 培養(yǎng)基26-27
• 2.1.3 主要試劑27
• 2.1.4 主要儀器設(shè)備27
• 2.1.5 茶水浸提液制備27
• 2.2 方法27-29
• 2.2.1 菌種活化28
• 2.2.2 漆酶酶活測定28
• 2.2.3 產(chǎn)漆酶菌株平板初篩28
• 2.2.4 產(chǎn)漆酶菌株搖瓶復(fù)篩28-29
• 2.3 結(jié)果與分析29-32
• 2.3.1 平板初篩29-31
• 2.3.2 搖瓶復(fù)篩31-32
• 2.3.3 菌株CSN-4發(fā)酵產(chǎn)酶曲線32
• 3 小結(jié)與討論32-34
• 第三章 菌株CSN-4產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件研究34-48
• 1 前言34
• 2 材料與方法34-37
• 2.1 材料34-35
• 2.1.1 供試菌株34
• 2.1.2 培養(yǎng)基34
• 2.1.3 主要試劑34-35
• 2.1.4 主要儀器設(shè)備35
• 2.2 方法35-37
• 2.2.1 漆酶活力測定35
• 2.2.2 不同營養(yǎng)成分對菌株CSN-4產(chǎn)漆酶酶活的影響35-36
• 2.2.3 不同培養(yǎng)條件對菌株CSN-4菌株產(chǎn)漆酶酶活的影響36
• 2.2.4 正交試驗(yàn)36-37
• 2.2.5 數(shù)據(jù)處理37
• 3 結(jié)果與分析37-45
• 3.1 不同C源物質(zhì)對菌株CSN-4漆酶酶活的影響37
• 3.2 麩皮用量對菌株CSN-4漆酶酶活的影響37-38
• 3.3 不同N源物質(zhì)對菌株CSN-4漆酶酶活的影響38
• 3.4 蛋白胨加入量對菌株CSN-4漆酶酶活的影響38-39
• 3.5 茶水濃度對菌株CSN-4漆酶酶活的影響39
• 3.6 CuSO_4加入量對菌株CSN-4漆酶酶活的影響39-40
• 3.7 培養(yǎng)基成分的正交試驗(yàn)40-41
• 3.8 不同裝液量對菌株CSN-4漆酶酶活的影響41-42
• 3.9 不同接菌量對菌株CSN-4漆酶酶活的影響42
• 3.10 培養(yǎng)基初始pH對菌株CSN-4漆酶酶活的影響42-43
• 3.11 培養(yǎng)溫度對菌株CSN-4漆酶酶活的影響43
• 3.12 不同搖床轉(zhuǎn)速對菌株CSN-4漆酶酶活的影響43-44
• 3.13 培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)優(yōu)化44-45
• 4 小結(jié)與討論45-48
• 第四章 菌株CSN-4漆酶分離純化及酶學(xué)性質(zhì)的研究48-64
• 1 前言48
• 2 材料和方法48-54
• 2.1 材料48-50
• 2.1.1 菌株及培養(yǎng)48
• 2.1.2 主要試劑48-49
• 2.1.3 主要儀器49
• 2.1.4 試劑配制49-50
• 2.2 方法50-54
• 2.2.1 蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳50-51
• 2.2.2 蛋白含量的測定51
• 2.2.3 漆酶的分離純化51-53
• 2.2.3.1 硫酸銨飽和度的確定51-52
• 2.2.3.2 酶粗液硫酸銨分級(jí)沉淀52
• 2.2.3.3 DEAE-纖維素陰離子交換柱層析52
• 2.2.3.4 葡聚糖G-150凝膠層析52-53
• 2.2.3.5 SDS-PAGE凝膠電泳53
• 2.2.3.6 純化倍數(shù)及回收率的計(jì)算53
• 2.2.4 漆酶酶學(xué)性質(zhì)的研究53-54
• 2.2.4.1 最適反應(yīng)溫度53
• 2.2.4.2 最適反應(yīng)pH53
• 2.2.4.3 漆酶的熱穩(wěn)定性53
• 2.2.4.4 漆酶的酸堿穩(wěn)定性53-54
• 2.2.4.5 Cu~(2+)對酶活性的影響54
• 3 結(jié)果與分析54-61
• 3.1 漆酶的分離純化54-59
• 3.1.1 粗酶液階段54
• 3.1.2 硫酸銨分級(jí)沉淀的確定54-55
• 3.1.3 酶粗液硫酸銨分級(jí)沉淀55
• 3.1.4 DEAE-纖維素陰離子交換柱層析55-56
• 3.1.5 葡聚糖G-150凝膠層析56-57
• 3.1.6 漆酶各步純化結(jié)果及純度鑒定57-59
• 3.2 漆酶酶學(xué)性質(zhì)59-61
• 3.2.1 最適反應(yīng)溫度59
• 3.2.2 最適反應(yīng)pH59-60
• 3.2.3 漆酶的熱穩(wěn)定性60
• 3.2.4 漆酶的酸堿穩(wěn)定性60
• 3.2.5 Cu~(2+)對酶活性的影響60-61
• 4 小結(jié)與討論61-64
• 第五章 漆酶轉(zhuǎn)化茶多酚的初步研究64-74
• 1 前言64
• 2 材料與方法64-65
• 2.0 漆酶64
• 2.1 主要試劑和儀器64
• 2.2 方法64-65
• 2.2.1 漆酶對茶多酚溶液生物轉(zhuǎn)化65
• 2.2.2 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC分析65
• 3 結(jié)果與分析65-71
• 3.1 酶液量對茶多酚溶液生物轉(zhuǎn)化的影響65-67
• 3.2 反應(yīng)時(shí)間對茶多酚溶液生物轉(zhuǎn)化的影響67-68
• 3.3 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC分析68-71
• 3.3.1 標(biāo)樣和空白對照的HPLC分析68-69
• 3.3.2 粗酶和純酶對茶多酚轉(zhuǎn)化后的HPLC分析69-71
• 4 小結(jié)與討論71-74
• 第六章 結(jié)論與展望74-76
• 1 結(jié)論74-75
• 2 展望75-76
• 參考文獻(xiàn)76-84
• 攻讀學(xué)位期間承擔(dān)的科研任務(wù)與主要成果84-86
• 致謝86-88
• 個(gè)人簡歷88-92

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 宛曉春;李大祥;張正竹;夏濤;凌鐵軍;陳琪;;茶葉生物化學(xué)研究進(jìn)展[J];茶葉科學(xué);2015年01期

2 黃磊;楊軍國;付杰;夏小歡;裘s

本文編號(hào)：340675