鵝源星狀病毒的分離鑒定及相關(guān)生物學(xué)特性的研究
發(fā)布時間：2021-09-03 07:31
星狀病毒（Astrovirus,AstV）是一種沒有囊膜且單股正鏈的RNA病毒,屬于星狀病毒科。該病毒目前已從多種哺乳動物以及雞、火雞、鴨、鵝和鴿子等禽類中檢測出來,與多種動物的腹瀉疾病有關(guān)。自2017年,在我國山東、安徽、廣東、湖南和江蘇等地陸續(xù)出現(xiàn)雛鵝內(nèi)臟型痛風(fēng)病的報道,鵝源星狀病毒是引起該病的病原,其致死率可達30%以上,導(dǎo)致養(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)嚴重的經(jīng)濟損失。本研究利用RT-PCR檢測鵝源星狀病毒陽性;收集結(jié)果為陽性的死亡鵝病料的內(nèi)臟研磨上清進行病毒分離;分離獲得兩株穩(wěn)定繁殖的星狀病毒毒株:GAstV/Goose/2019/HLJPF和GAstV/Goose/2018/HLJ01;其中GAstV/Goose/2019/HLJPF的ELD50為10-2.6/0.2mL。鵝胚分離傳代結(jié)果表明病毒接種鵝胚可使胚體全身出血、體生長發(fā)育受到抑制或死亡等病變。分析NCBI上公布的GAstV序列,設(shè)計合成了一組引物,采取了RT-PCR技術(shù)來擴增GAstV的基因組片段,獲取GAstV的核酸序列進而拼接GAstV的全基因組,并分析了GAstV的結(jié)構(gòu)組成、抗原表位、...
【文章來源】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)黑龍江省
【文章頁數(shù)】：80 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
人星狀病毒Fig.1-1ElectronmicroscopyofHAstV
文獻綜述3圖1-2星狀病毒全基因組結(jié)構(gòu)Fig.1-2CompletegenomeorganizationsofAstV1.2.4病毒非結(jié)構(gòu)蛋白與結(jié)構(gòu)蛋白ORF1a和ORF1b構(gòu)成了星狀病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。其中ORF1a編碼nspla蛋白（約102kDa），ORF1a與ORF1b經(jīng)由核糖體移位機制編碼形成了nsplab（約160kDa）蛋白[20]。在病毒自身編碼的蛋白酶水解以及細胞蛋白酶的作用之下，Nsp1a和nsplab形成了病毒蛋白酶（v-Pro），RdRp和病毒基因組連接蛋白（VPg）等小分子蛋白[20]。RdRp是由ORF1b編碼的RFS進行翻譯的，RdRp在病毒的復(fù)制中起著關(guān)鍵的作用，但是絕大多數(shù)的RdRp的校對功能匱乏，而且其保真性有缺陷，十分容易在復(fù)制過程中出現(xiàn)錯配和突變進而引起病毒的高度變異[13]。星狀病毒的衣殼結(jié)構(gòu)蛋白（CP）是由ORF2編碼的[21]。根據(jù)保守性的高低可將病毒的衣殼蛋白劃分成為兩個區(qū)域：一個高度保守的N端，同時具有一個必需氨基酸區(qū)域，進而構(gòu)成病毒衣殼的內(nèi)核部分；另一個為構(gòu)成病毒衣殼的突起部分的高度變異的C端。TAstV-2、DAstV和CAstV等星狀病毒都具有由25~32個堿性氨基酸組成的衣殼蛋白N端，并且都擁有一個保守的SRSRSRSRSR基序。然而在TAstV-1和ANV中，它們的衣殼蛋白N端并未擁有重復(fù)的SR基序[22]。衣殼蛋白通過與宿主相互作用來決定細胞向性、介導(dǎo)細胞入侵進而激發(fā)宿主的免疫應(yīng)答，也可以包裹病毒核酸，同時它也是星狀病毒的結(jié)構(gòu)屏障[23]。目前已有研究表明星狀病毒衣殼蛋白可以抑制經(jīng)典的和甘露糖補體途徑，它通過結(jié)合補體C1和甘露糖凝集素（MBL）形成了一種獨特的補體通路抑制劑[24]。另有發(fā)現(xiàn)星狀病毒衣殼蛋白有腸毒素的潛在作用[1,25]。1.3星狀病毒的培養(yǎng)特性與理化性質(zhì)研究早期鑒于缺乏病毒相適應(yīng)的實驗室宿主系統(tǒng)，研究人員對星狀病毒的生長特性的了解十分的匱乏。1990年，Shimizu等[26]?
鵝源星狀病毒的分離鑒定及相關(guān)生物學(xué)特性的研究162.3.1自然感染病例的臨床癥狀及病變臨床上，雛鵝多在5日齡左右開始發(fā)病，發(fā)病雛鵝在12日齡左右達到死亡高峰，雛鵝長至20日齡左右時，鵝群的死亡率可達50%。感染AstV的雛鵝臨床表現(xiàn)為精神沉郁，倦動厭食，排灰白色稀便。剖檢死亡鵝可見內(nèi)臟器官肝臟、心臟表面有大量白色尿酸鹽沉積，腎臟出血腫大，表面及輸尿管內(nèi)也可見明顯的灰白色尿酸鹽，膽汁中有大量尿酸鹽顆粒（圖2-1）。固定發(fā)病鵝肝臟和腎臟組織，HE染色結(jié)果表明肝臟實質(zhì)內(nèi)可見多處炎性細胞浸潤灶，肝細胞變性壞死；腎皮質(zhì)近漿膜面局部出血，皮質(zhì)腎小管上皮細胞變性，多量壞死；腎小球囊擴張，系膜細胞數(shù)量減少，皮質(zhì)腎小管上皮細胞變性，多量壞死（圖2-1）。研磨后的肝臟組織液經(jīng)磷鎢酸負染后，電鏡觀察到約20-30nm的病毒粒子（圖2-2）。圖2-1自然感染死亡鵝只組織剖檢病變Fig.2-1PostmortemexaminationofdeadgoosewithnaturalinfectionA:Urate-likeexudationofliverandheart;B:Kidneysurfaceuratedeposits,uretersfilledwithurate;C:A：肝臟、心臟包被尿酸鹽樣滲出；B：腎臟尿酸鹽沉積，輸尿管充滿尿酸鹽；C：膽囊內(nèi)充滿尿酸鹽；D：肝臟實質(zhì)炎性細胞浸潤，肝細胞變性壞死；E：腎皮質(zhì)局部出血，腎小管上皮細胞變性壞死；F：腎小球囊擴張，皮質(zhì)腎小管上皮細胞變性壞死。Gallbladderfilledwithurate;D:Liverparenchymalinflammatorycellinfiltration,livercelldegenerationandnecrosis;E:Localrenalcortexbleeding,renaltubularepithelialcellsdegenerationandnecrosis;F:Glomerulardilatation,degenerationandnecrosisofcorticalrenaltubularepithelialcells.2.3結(jié)果
【參考文獻】：
期刊論文
[1]新發(fā)雛鵝痛風(fēng)研究進展[J]. 馬軍. 山東畜牧獸醫(yī). 2019(07)
[2]豬星狀病毒ORF2基因的克隆及序列分析[J]. 蘭家暖,劉磊,郭旋,劉歡,盧冰霞,張民秀,廖承球,黃偉堅. 中國獸醫(yī)雜志. 2012(12)
碩士論文
[1]豬星狀病毒1型（PAstV1）GX1株的致病性研究[D]. 王翠.廣西大學(xué) 2019
[2]鴨星狀病毒1型D51株DNA-launched感染性克隆的構(gòu)建與病毒拯救[D]. 李海娥.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[3]豬星狀病毒分離鑒定及其全基因組序列分析和衣殼蛋白原核表達[D]. 劉歡.廣西大學(xué) 2014
本文編號：3380693
【文章來源】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)黑龍江省
【文章頁數(shù)】：80 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
人星狀病毒Fig.1-1ElectronmicroscopyofHAstV
文獻綜述3圖1-2星狀病毒全基因組結(jié)構(gòu)Fig.1-2CompletegenomeorganizationsofAstV1.2.4病毒非結(jié)構(gòu)蛋白與結(jié)構(gòu)蛋白ORF1a和ORF1b構(gòu)成了星狀病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。其中ORF1a編碼nspla蛋白（約102kDa），ORF1a與ORF1b經(jīng)由核糖體移位機制編碼形成了nsplab（約160kDa）蛋白[20]。在病毒自身編碼的蛋白酶水解以及細胞蛋白酶的作用之下，Nsp1a和nsplab形成了病毒蛋白酶（v-Pro），RdRp和病毒基因組連接蛋白（VPg）等小分子蛋白[20]。RdRp是由ORF1b編碼的RFS進行翻譯的，RdRp在病毒的復(fù)制中起著關(guān)鍵的作用，但是絕大多數(shù)的RdRp的校對功能匱乏，而且其保真性有缺陷，十分容易在復(fù)制過程中出現(xiàn)錯配和突變進而引起病毒的高度變異[13]。星狀病毒的衣殼結(jié)構(gòu)蛋白（CP）是由ORF2編碼的[21]。根據(jù)保守性的高低可將病毒的衣殼蛋白劃分成為兩個區(qū)域：一個高度保守的N端，同時具有一個必需氨基酸區(qū)域，進而構(gòu)成病毒衣殼的內(nèi)核部分；另一個為構(gòu)成病毒衣殼的突起部分的高度變異的C端。TAstV-2、DAstV和CAstV等星狀病毒都具有由25~32個堿性氨基酸組成的衣殼蛋白N端，并且都擁有一個保守的SRSRSRSRSR基序。然而在TAstV-1和ANV中，它們的衣殼蛋白N端并未擁有重復(fù)的SR基序[22]。衣殼蛋白通過與宿主相互作用來決定細胞向性、介導(dǎo)細胞入侵進而激發(fā)宿主的免疫應(yīng)答，也可以包裹病毒核酸，同時它也是星狀病毒的結(jié)構(gòu)屏障[23]。目前已有研究表明星狀病毒衣殼蛋白可以抑制經(jīng)典的和甘露糖補體途徑，它通過結(jié)合補體C1和甘露糖凝集素（MBL）形成了一種獨特的補體通路抑制劑[24]。另有發(fā)現(xiàn)星狀病毒衣殼蛋白有腸毒素的潛在作用[1,25]。1.3星狀病毒的培養(yǎng)特性與理化性質(zhì)研究早期鑒于缺乏病毒相適應(yīng)的實驗室宿主系統(tǒng)，研究人員對星狀病毒的生長特性的了解十分的匱乏。1990年，Shimizu等[26]?
鵝源星狀病毒的分離鑒定及相關(guān)生物學(xué)特性的研究162.3.1自然感染病例的臨床癥狀及病變臨床上，雛鵝多在5日齡左右開始發(fā)病，發(fā)病雛鵝在12日齡左右達到死亡高峰，雛鵝長至20日齡左右時，鵝群的死亡率可達50%。感染AstV的雛鵝臨床表現(xiàn)為精神沉郁，倦動厭食，排灰白色稀便。剖檢死亡鵝可見內(nèi)臟器官肝臟、心臟表面有大量白色尿酸鹽沉積，腎臟出血腫大，表面及輸尿管內(nèi)也可見明顯的灰白色尿酸鹽，膽汁中有大量尿酸鹽顆粒（圖2-1）。固定發(fā)病鵝肝臟和腎臟組織，HE染色結(jié)果表明肝臟實質(zhì)內(nèi)可見多處炎性細胞浸潤灶，肝細胞變性壞死；腎皮質(zhì)近漿膜面局部出血，皮質(zhì)腎小管上皮細胞變性，多量壞死；腎小球囊擴張，系膜細胞數(shù)量減少，皮質(zhì)腎小管上皮細胞變性，多量壞死（圖2-1）。研磨后的肝臟組織液經(jīng)磷鎢酸負染后，電鏡觀察到約20-30nm的病毒粒子（圖2-2）。圖2-1自然感染死亡鵝只組織剖檢病變Fig.2-1PostmortemexaminationofdeadgoosewithnaturalinfectionA:Urate-likeexudationofliverandheart;B:Kidneysurfaceuratedeposits,uretersfilledwithurate;C:A：肝臟、心臟包被尿酸鹽樣滲出；B：腎臟尿酸鹽沉積，輸尿管充滿尿酸鹽；C：膽囊內(nèi)充滿尿酸鹽；D：肝臟實質(zhì)炎性細胞浸潤，肝細胞變性壞死；E：腎皮質(zhì)局部出血，腎小管上皮細胞變性壞死；F：腎小球囊擴張，皮質(zhì)腎小管上皮細胞變性壞死。Gallbladderfilledwithurate;D:Liverparenchymalinflammatorycellinfiltration,livercelldegenerationandnecrosis;E:Localrenalcortexbleeding,renaltubularepithelialcellsdegenerationandnecrosis;F:Glomerulardilatation,degenerationandnecrosisofcorticalrenaltubularepithelialcells.2.3結(jié)果
【參考文獻】：
期刊論文
[1]新發(fā)雛鵝痛風(fēng)研究進展[J]. 馬軍. 山東畜牧獸醫(yī). 2019(07)
[2]豬星狀病毒ORF2基因的克隆及序列分析[J]. 蘭家暖,劉磊,郭旋,劉歡,盧冰霞,張民秀,廖承球,黃偉堅. 中國獸醫(yī)雜志. 2012(12)
碩士論文
[1]豬星狀病毒1型（PAstV1）GX1株的致病性研究[D]. 王翠.廣西大學(xué) 2019
[2]鴨星狀病毒1型D51株DNA-launched感染性克隆的構(gòu)建與病毒拯救[D]. 李海娥.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[3]豬星狀病毒分離鑒定及其全基因組序列分析和衣殼蛋白原核表達[D]. 劉歡.廣西大學(xué) 2014
本文編號：3380693
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