γ-氨基丁酸（GABA）是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì),具有一系列重要的生理功能。GABA作為一種功能性食品保健因子其制備和應(yīng)用一直備受人們關(guān)注。谷氨酸脫羧酶（GAD）是生物催化生產(chǎn)GABA的關(guān)鍵限速酶。GABA的傳統(tǒng)發(fā)酵法產(chǎn)量較低,不適合GABA的規(guī)�；a(chǎn),利用GAD通過體外催化合成GABA是一種簡單經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)方式。為了獲取GABA生產(chǎn)所必需的GAD,本研究構(gòu)建了一株重組工程菌E.coli BL21-pGEX-4T-gadB,經(jīng)表達(dá)純化獲得高活力GAD,并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.以植物乳桿菌L.plantarumQL-14基因組序列為模版,設(shè)計(jì)了一對特異性引物并擴(kuò)增谷氨酸脫羧酶編碼基因gadB,將其連接至融合表達(dá)載體pGEX-4T-3構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-gadB并轉(zhuǎn)化至E.coli BL21構(gòu)建大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)。測序結(jié)果顯示谷氨酸脫羧酶編碼基因gadB與GeneBank上已發(fā)表的植物乳桿菌L.plantarum WCFS1中g(shù)ad基因序列同源性最高相似度為99.6%。2.利用生物信息學(xué)分析方法對克隆GAD進(jìn)行序列及結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)gadB基因ORF全長1... 

【文章來源】：廣西科技大學(xué)廣西壯族自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 γ-氨基丁酸（GABA）概述
        1.1.1 GABA及其結(jié)構(gòu)特性
        1.1.2 GABA的生理功能
        1.1.3 GABA的應(yīng)用
        1.1.4 GABA的制備方法
        1.1.5 GABA測定方法
    1.2 谷氨酸脫羧酶（GAD）
        1.2.1 谷氨酸脫羧酶概述
        1.2.2 動物GAD
        1.2.3 植物GAD
        1.2.4 微生物GAD
        1.2.5 微生物GAD在代謝途徑中的作用
        1.2.6 GAD分子生物學(xué)研究
    1.3 本研究目的意義及研究內(nèi)容
        1.3.1 本研究目的及主要內(nèi)容
        1.3.2 創(chuàng)新點(diǎn)
第二章 gadB基因的克隆及重組表達(dá)工程菌的構(gòu)建
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌種及載體
        2.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑
        2.1.3 引物合成及測序
        2.1.4 主要酶制劑和試劑盒
        2.1.5 主要儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化
        2.2.2 gadB基因的克隆
        2.2.3 重組表達(dá)工程菌的構(gòu)建
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 目的基因PCR擴(kuò)增
        2.3.2 TA克隆結(jié)果的驗(yàn)證
        2.3.3 目的基因連接至表達(dá)載體
        2.3.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的驗(yàn)證
    2.4 本章小結(jié)
第三章 重組GAD序列及其結(jié)構(gòu)分析
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 材料
        3.1.2 主要數(shù)據(jù)庫及軟件
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 GAD序列及結(jié)構(gòu)域分析
        3.2.2 GAD的基本信息分析
        3.2.3 GAD二級結(jié)構(gòu)預(yù)測
        3.2.4 GAD三級結(jié)構(gòu)預(yù)測
        3.2.5 多重序列比對
        3.2.6 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 GAD序列和結(jié)構(gòu)域分析
        3.3.2 重組GAD氨基酸組成及其理化性質(zhì)
        3.3.3 疏水性結(jié)構(gòu)分析
        3.3.4 二級結(jié)構(gòu)分析
        3.3.5 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測
        3.3.6 多重序列比對
        3.3.7 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建
    3.4 本章小結(jié)
第四章 重組GAD表達(dá)純化及其活力分析
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 菌種
        4.1.2 主要試劑及其配制方法
        4.1.3 主要藥品和試劑
        4.1.4 主要儀器設(shè)備
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        4.2.2 重組蛋白的表達(dá)條件優(yōu)化
        4.2.3 融合蛋白可溶性驗(yàn)證
        4.2.4 目的蛋白的分離純化
        4.2.5 純化目的蛋白GAD濃度的測定
        4.2.6 重組GAD活力測定
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        4.3.2 表達(dá)條件優(yōu)化
        4.3.3 融合蛋白的可溶性分析
        4.3.4 目的蛋白的分離純化
        4.3.5 重組GAD活力分析
    4.4 本章小結(jié)
第五章 重組GAD酶學(xué)性質(zhì)研究
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 菌種與培養(yǎng)基
        5.1.2 主要藥品及儀器
        5.1.3 主要試劑的配制方法
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 最適pH的確定及pH穩(wěn)定性
        5.2.2 最適反應(yīng)溫度的確定及溫度穩(wěn)定性
        5.2.3 輔酶PLP濃度對酶活力的影響
        5.2.4 金屬離子及EDTA對酶活的影響
        5.2.5 表面活性劑對酶活力的影響
        5.2.6 有機(jī)溶劑對酶活力的影響
        5.2.7 米氏常數(shù)的確定
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 最適pH的確定及pH穩(wěn)定性
        5.3.2 最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性
        5.3.3 輔酶PLP濃度對酶活力的影響
        5.3.4 不同金屬離子及EDTA對酶活的影響
        5.3.5 表面活性劑對酶活力的影響
        5.3.6 有機(jī)溶劑對酶活力的影響
        5.3.7 米氏常數(shù)
    5.4 本章小結(jié)
第六章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 展望
參考文獻(xiàn)
發(fā)表論文和參加科研情況說明
致謝



本文編號：3348770