大豆[Glycine max（L.）Merr],富含不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、大豆皂苷、大豆異黃酮等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),因此又被人們稱為“植物肉”,在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占重要地位。大豆異黃酮屬于黃酮類化合物,是大豆發(fā)育過(guò)程中次生代謝的產(chǎn)物。作為一種植物性雌激素,其具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,大豆異黃酮能影響蛋白質(zhì)的合成、生長(zhǎng)因子活性和激素分泌等。研究發(fā)現(xiàn)其藥理作用豐富,如抗氧化,預(yù)防和治療心血管疾病、更年期綜合癥、骨質(zhì)疏松癥等,是目前醫(yī)療領(lǐng)域研究的潛在抗癌物質(zhì)。因此選育高異黃酮大豆品種對(duì)于醫(yī)療健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展都具有積極意義。研究表明大豆異黃酮的含量除由其合成分解過(guò)程中相關(guān)酶基因決定外,還受到MYB類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。MYB型轉(zhuǎn)錄因子是功能最為多樣的一類轉(zhuǎn)錄因子,目前已有研究證實(shí)MYB轉(zhuǎn)錄因子參與了植物中苯丙烷次級(jí)代謝途徑的調(diào)控,黃酮類代謝途徑就是其分支之一。研究表明,MYB類轉(zhuǎn)錄因子可以正向調(diào)控大豆異黃酮的積累,但也有研究證實(shí)GmMYB39基因的過(guò)表達(dá)會(huì)抑制大豆異黃酮的合成^[1]。MYB類轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能廣泛,其功能涉及植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫以及植物次生代謝等多方面。這些先前的研究成果為GmM... 

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異黃酮合成途徑及苯丙烷類代謝途徑分支Figure1.1Isoflavonesynthesispathwayandphenylpropanemetabolicpathwaybranch在異黃酮的合成路徑中，在查爾酮還原酶（CHR）、查爾酮合酶（CHS）、

第二章GmMYB12B2轉(zhuǎn)基因植株的鑒定20間。加入的一抗可回收再利用，一般不超過(guò)3次）。⑤二抗加入1×PBST溶液10或15ml，根據(jù)比例加入二抗，于搖床上輕緩震蕩孵育1h，孵育完成后用1×PBST溶液洗3次，每次10min。⑥顯影將處理好的膜放置在顯影板上，用移液器在膜表面均勻鋪上提前配置好的曝光液、放入超微弱化學(xué)發(fā)光儀中顯影。2.3結(jié)果2.3.1GmMYB12B2轉(zhuǎn)基因植株P(guān)AT試紙條檢測(cè)PAT蛋白試紙條可快速鑒別出含有PAT/bar蛋白的樣品，且檢測(cè)結(jié)果明顯。檢測(cè)PAT/bar蛋白前，加提取緩沖液提取樣品蛋白，PAT/bar蛋白溶解于緩沖液中。每條試紙兩端均有吸收墊，試紙上的箭頭指示插入反應(yīng)管的一端。樣品溶液通過(guò)試紙上的薄膜滲透并被吸入上端，在試紙條中間區(qū)域觀察反應(yīng)結(jié)果。對(duì)于含有PAT/bar蛋白的檢測(cè)樣品，檢測(cè)線(TestLine)將會(huì)顯色，即有指示帶和檢測(cè)帶兩條帶，該結(jié)果判定為陽(yáng)性結(jié)果。如果檢測(cè)樣品為陰性，則試紙上僅顯示一條帶即指示帶。以未轉(zhuǎn)基因的受體植株材料為陰性對(duì)照，進(jìn)一步鑒定陽(yáng)性植株。如圖2.1所示，以未轉(zhuǎn)基因的W82植株為陰性對(duì)照，PAT蛋白試紙條結(jié)果表明，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因株系的單株中MYB-1，MYB-2，MYB-3植株P(guān)AT蛋白試紙條檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。圖2.1PAT試紙條檢測(cè)GmMYB12B2轉(zhuǎn)基因植株Figure2.1PATteststripdetectionofGmMYB12B2transgenicplants

第二章GmMYB12B2轉(zhuǎn)基因植株的鑒定212.3.2GmMYB12B2轉(zhuǎn)基因植株Southernblot檢測(cè)以bar序列設(shè)計(jì)上下游引物，PTF101質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增bar基因片段，回收純化后制備地高辛探針。以PTF-101質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，受體材料大豆葉片總DNA為陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)基因植株葉片總DNA為雜交樣品，用HindIII進(jìn)行37℃過(guò)夜酶切，驗(yàn)證外源bar基因是否轉(zhuǎn)入大豆中，Southernblot雜交結(jié)果如圖2.2所示，Southern雜交中陰性對(duì)照無(wú)相應(yīng)條帶，而MYB-1，MYB-2，MYB-3轉(zhuǎn)基因株系均出現(xiàn)一條條帶，表明MYB-1，MYB-2，MYB-3株系均為陽(yáng)性植株，表明bar基因己整合到大豆基因組當(dāng)中，且是以單拷貝的形式插入。圖2.2Southernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆中bar基因的整合情況Figure2.2Southernblotdetectionoftheintegrationofbargenesintransgenicsoybeans通過(guò)Southernblot雜交實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)材料中外源bar基因的插入方式是以單拷貝形式插入，且初步確定了這些轉(zhuǎn)基因材料都為陽(yáng)性植株，因此這些轉(zhuǎn)基因材料可用以后續(xù)的轉(zhuǎn)基因安全性實(shí)驗(yàn)。2.3.3GmMYB12B2轉(zhuǎn)基因植株Westernblot檢測(cè)本研究通過(guò)WesternBlot方法分析測(cè)定了外源bar蛋白在轉(zhuǎn)基因大豆組織中的表達(dá)水平，進(jìn)一步驗(yàn)證MYB轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)基因大豆后代中的表達(dá)情況。以未轉(zhuǎn)基因的W82大豆材料為陰性對(duì)照，以按一定比例稀釋的bar蛋白為陽(yáng)性對(duì)照，使用PAT抗體進(jìn)行的Westernblot結(jié)果如圖2.3顯示，轉(zhuǎn)基因大豆MYB-1，MYB-2，23130bp9416bp6557bp4361bp2322bp2027bp564bp

【參考文獻(xiàn)】：
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博士論文
[1]大豆兩個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及其功能分析[D]. 李曉薇.吉林大學(xué) 2011

碩士論文
[1]吉林35大豆胚尖遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及GmMYB12B2基因的遺傳轉(zhuǎn)化[D]. 田美.吉林大學(xué) 2019
[2]調(diào)控大豆異黃酮合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與表達(dá)模式分析[D]. 田玲.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2014



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