為了檢測(cè)EMCV是否通過內(nèi)吞途徑感染宿主細(xì)胞,本研究使用內(nèi)吞途徑抑制劑作用于BHK-21細(xì)胞后進(jìn)行EMCV攻毒,通過病毒滴度、病毒拷貝數(shù)和病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)EMCV的感染受到抑制,提示EMCV可通過內(nèi)吞途徑感染BHK-21細(xì)胞。然后在EMCV感染BHK-21細(xì)胞的過程中對(duì)內(nèi)吞途徑標(biāo)志蛋白EEA1和病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1進(jìn)行定位檢測(cè),發(fā)現(xiàn)二者在病毒感染細(xì)胞過程中共定位現(xiàn)象明顯,證明EMCV可通過內(nèi)吞途徑感染BHK-21細(xì)胞。為了確定EMCV具體通過何種內(nèi)吞途徑感染宿主細(xì)胞,分別使用多種內(nèi)吞途徑抑制劑作用于BHK-21細(xì)胞后進(jìn)行EMCV攻毒,檢測(cè)EMCV對(duì)細(xì)胞的感染是否受到影響以確定EMCV通過何種內(nèi)吞途徑感染宿主細(xì)胞。結(jié)果提示EMCV不通過Clathrin依賴型內(nèi)吞途徑和巨胞飲途徑感染細(xì)胞,但通過Caveolin依賴型內(nèi)吞途徑感染BHK-21細(xì)胞。然后又檢測(cè)了兩種對(duì)Caveolin依賴型內(nèi)吞途徑至關(guān)重要的蛋白——肌動(dòng)蛋白（Actin）和發(fā)動(dòng)蛋白（Dynamin）對(duì)EMCV感染BHK-21細(xì)胞的影響,結(jié)果提示肌動(dòng)蛋白和發(fā)動(dòng)蛋白同樣影響EMCV感染BHK-21細(xì)胞。最后進(jìn)行細(xì)胞接毒之后... 

【文章來源】：西北民族大學(xué)甘肅省

【文章頁(yè)數(shù)】：77 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

細(xì)胞內(nèi)吞途徑[97]

19為極顯著，圖中顯示為***。3結(jié)果3.1抑制劑適宜濃度篩選篩選不影響細(xì)胞活力的8種抑制劑適宜工作濃度如圖1所示：內(nèi)吞途徑抑制劑NH4Cl的適宜工作濃度為10mM和20mM，bafilomycinA1為10nM和20nM；Clathrin依賴型內(nèi)吞途徑抑制劑Chlorpromazine的適宜工作濃度為5μM和10μM，Pitstop為5μM和10μM；Caveolin依賴型內(nèi)吞途徑抑制劑nystatin的適宜工作濃度為12.5μg/mL和25μg/mL，MβCD為2.5mM和5mM；發(fā)動(dòng)蛋白抑制劑dynasore的適宜工作濃度為20μM和40μM，mitmab為5μM和10μM；肌動(dòng)蛋白抑制劑CytochalasinD的適宜工作濃度為5μM和10μM，Jasplakinolide為5μM和10μM；巨胞飲途徑抑制劑IPA-3的適宜工作濃度為7.5μM和15μM，wortmannin為5μM和10μM。圖1抑制劑濃度篩選

21圖2內(nèi)吞途徑抑制劑作用于BHK-細(xì)胞對(duì)EMCV感染細(xì)胞的影響Fig.2TheimpactofEMCVinfectBHK-21cellsdealtwithendocyticpathwayinhibitorA:NH4Cl作用下VP1蛋白檢測(cè)；B:NH4Cl作用下病毒滴度檢測(cè)；C:NH4Cl作用下病毒拷貝數(shù)檢測(cè)；D:bafilomycinA1作用下VP1蛋白檢測(cè)；E:bafilomycinA1作用下病毒滴度檢測(cè)；F:bafilomycinA1作用下病毒拷貝數(shù)檢測(cè)；ns:P>0.05;*:P<0.05;**:P<0.01;***<0.001。A:VP1proteindetectionafterdealwithNH4Cl;B:VirustiterdetectionafterdealwithNH4Cl;C:ViruscopiesdetectionafterdealwithNH4Cl;D:VP1proteindetectionafterdealwithbafmycinA1;E:VirustiterdetectionafterdealwithbafilomycinA1;F:ViruscopiesdetectionafterdealwithbafilomycinA1;ns:P>0.05;*:P<0.05;**:P<0.01;***<0.001.3.3內(nèi)吞標(biāo)志蛋白EEA1與EMCVVP1定位檢測(cè)在EMCV感染BHK-21細(xì)胞的過程中用免疫熒光法對(duì)EMCV的結(jié)構(gòu)蛋白VP1和內(nèi)吞途徑標(biāo)志性蛋白EEA1染色，于共聚焦顯微鏡下觀察EMCVVP1和EEA1的定位結(jié)果如圖3所示，病毒粒子VP1蛋白呈現(xiàn)明顯綠色，EEA1呈現(xiàn)明顯紅色，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色；在Merge圖中可以看出EMCV和EEA1在核周圍有明顯的橘黃色共定位區(qū)域。


本文編號(hào)：3291854