發(fā)布時(shí)間：2017-04-26 16:04

  本文關(guān)鍵詞：微生物脂肪酶庫構(gòu)建及磷脂酶D的篩選與應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：脂肪酶作為工業(yè)大宗酶之一,能夠催化水解、酯合、酯交換、醇解、酸解、氨解等反應(yīng),被廣泛地用于食品、醫(yī)藥、紡織、飼料、洗滌、造紙、生物柴油及環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域。微生物脂肪酶相比于動(dòng)植物來源脂肪酶具有來源廣泛、易于制備、底物特異性較強(qiáng)、催化效率較高、反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物較少等優(yōu)點(diǎn)。伴隨著脂肪酶應(yīng)用范圍的擴(kuò)大,對(duì)其特異性的要求也逐漸提高,從自然界中篩選特異性脂肪酶菌株是一個(gè)較為簡(jiǎn)便可行的方法。利用維多利亞藍(lán)和皂化鈣圈的方法我們從19份內(nèi)陸土壤樣品和22份南海深海沉積物樣品中平板初篩獲得538株產(chǎn)酶菌株。復(fù)篩我們采用特異性酶活測(cè)定方法,脂肪酶水解活力采用p-NP法,磷脂酶D水解酶活力采用酶聯(lián)比色法,酯合活力采用棕櫚酸乙酯法,轉(zhuǎn)酯活力采用DHA甘油酯法。復(fù)篩結(jié)果顯示538株初篩菌株中具有脂肪酶水解活力的菌株有295株；具有PLD水解活力菌株有293株；具有酯合成活力的菌株有138株：具有酯交換活力的菌株有23株。具有較高水解活力的菌株有57株：較高PLD水解活力的菌株有55株：較高酯合活力的菌株有3株。其中水解酶和PLD酶的相關(guān)度為45.08%,水解酶和酯合酶的相關(guān)度為27.5%,酯合酶和酯交換酶的相關(guān)度為82.1%。我們對(duì)部分南海特異性菌株進(jìn)行了16S rDNA鑒定分析,發(fā)現(xiàn)變形桿菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),其中嗜冷菌、芽孢桿菌、交替假單胞菌為優(yōu)勢(shì)菌屬。脂肪酶庫中538號(hào)菌株經(jīng)過16S rDNA鑒定為麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia),通過硫酸銨沉淀、DEAE離子交換層析和凝膠過濾層析獲得電泳純蛋白條帶。蛋白質(zhì)測(cè)序發(fā)現(xiàn)其屬于Ⅰ型磷脂酶含有GxSxG保守序列,相對(duì)分子質(zhì)量為41.8 KD,等電點(diǎn)為8.86。酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)該酶最適的催化溫度為40℃,最適pH為7-8,在10-40℃內(nèi)能夠保持酶活的穩(wěn)定性,在pH 5-12的范圍內(nèi)能夠維持80%以上活力,金屬離子Fe3+和化學(xué)試劑SDS能夠抑制90%以上的酶活。磷脂酶D(Phospholipid D,EC 3,1.4.4,縮寫PLD)能夠催化水解磷脂分子中4位酯鍵,生成磷脂酸和有機(jī)堿：同時(shí),還能通過堿基交換反應(yīng)催化各種羥基化合物與磷脂堿基結(jié)合形成新的磷脂。目前報(bào)道的大部分PLD的水解活性遠(yuǎn)高于轉(zhuǎn)堿基活性,這限制了其在制備單一磷脂和稀有磷脂等磷脂改性過程的應(yīng)用。本研究以脂肪酶庫中具有PLD水解活力菌株及大豆磷脂殘?jiān)鼮闃悠泛Y選具有堿基交換活性的PLD菌株,并將其用于磷脂酰絲氨酸合成。通過大量的篩選我們共獲得了6株具有磷脂酰絲氨酸合成能力菌株,分別對(duì)其進(jìn)行了16S rDNA鑒定。其中a2菌株經(jīng)過鑒定為抗輻射不動(dòng)桿菌(Acinetobacter radioresistens),其在雙相體系中50℃反應(yīng)12h磷脂酰絲氨酸的轉(zhuǎn)化率為47.8%,選擇率為74%,具有很好的應(yīng)用前景。利用H103大孔樹脂對(duì)Acinetobacter radioresistens a2的PLD進(jìn)行純化。步純化獲得了電泳純PLD蛋白,其相對(duì)分子量在40 KD左右。
【關(guān)鍵詞】：脂肪酶 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌 磷脂酶D 抗輻射不動(dòng)桿菌 磷脂酰絲氨酸
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q936
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 0 前言14-37
• 0.1 脂肪酶14-24
• 0.1.1 脂肪酶簡(jiǎn)介14-17
• 0.1.2 脂肪酶特性17-20
• 0.1.3 脂肪酶的應(yīng)用20-24
• 0.2 磷脂改性與磷脂酶D24-35
• 0.2.1 磷脂簡(jiǎn)介24-25
• 0.2.2 磷脂酰絲氨酸簡(jiǎn)介25-26
• 0.2.3 磷脂改性的方法26-30
• 0.2.4 磷脂酶D簡(jiǎn)介30-31
• 0.2.5 磷脂酶D的催化特性31-35
• 0.3 研究意義和主要研究?jī)?nèi)容35-37
• 0.3.1 研究意義35-36
• 0.3.2 研究?jī)?nèi)容36-37
• 1 微生物脂肪酶庫構(gòu)建及南海產(chǎn)脂肪酶微生物多樣性分析37-64
• 1.1 引言37-38
• 1.2 材料與方法38-50
• 1.2.1 樣品信息38-40
• 1.2.2 儀器與試劑40-41
• 1.2.3 培養(yǎng)基配方41-42
• 1.2.4 產(chǎn)脂肪酶微生物篩選42-49
• 1.2.5 細(xì)菌16S rDNA鑒定49-50
• 1.3 結(jié)果與討論50-62
• 1.3.1 產(chǎn)酶微生物酶活多樣性分析50-51
• 1.3.2 南海產(chǎn)脂肪酶微生物多樣性分析51-62
• 1.4 本章小結(jié)62-64
• 2 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌LH15脂肪酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)研究64-76
• 2.1 引言64
• 2.2 材料與方法64-68
• 2.2.1 儀器與試劑64
• 2.2.2 菌株64
• 2.2.3 培養(yǎng)基配方64-65
• 2.2.4 酶活測(cè)定方法65
• 2.2.5 蛋白質(zhì)測(cè)定方法65
• 2.2.6 LH15生長(zhǎng)曲線測(cè)定65
• 2.2.7 LH15純化65-66
• 2.2.8 SDS-PAGE檢測(cè)66-67
• 2.2.9 LH15酶學(xué)性質(zhì)67-68
• 2.2.10 蛋白測(cè)序68
• 2.3 結(jié)果與討論68-75
• 2.3.1 LH15的生長(zhǎng)曲線68-69
• 2.3.2 LH15進(jìn)化分析69
• 2.3.3 LH15脂肪酶的純化69-70
• 2.3.4 SDS-PAGE檢測(cè)70-71
• 2.3.5 LH15脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)71-73
• 2.3.6 蛋白測(cè)序73-75
• 2.4 本章小結(jié)75-76
• 3 具有轉(zhuǎn)堿基活性的磷脂酶D菌株篩選76-85
• 3.1 引言76
• 3.2 材料與方法76-79
• 3.2.1 樣品信息76-77
• 3.2.2 儀器與材料77
• 3.2.3 培養(yǎng)基配方77
• 3.2.4 具有轉(zhuǎn)堿基活性的PLD菌株篩選77-78
• 3.2.5 雙水相磷脂酰絲氨酸合成78
• 3.2.6 磷脂酰絲氨酸檢測(cè)78-79
• 3.2.7 細(xì)菌鑒定及進(jìn)化分析79
• 3.3 結(jié)果與討論79-83
• 3.3.1 脂肪酶庫篩選結(jié)果79-80
• 3.3.2 大豆磷脂殘?jiān)泻Y選80-81
• 3.3.3 具有轉(zhuǎn)堿基活性菌株16S rDNA鑒定81-82
• 3.3.4 具有轉(zhuǎn)堿基活性菌株進(jìn)化分析82-83
• 3.4 本章小結(jié)83-85
• 4 抗輻射不動(dòng)桿菌a2催化合成磷脂酰絲氨酸及其發(fā)酵純化85-90
• 4.1 引言85
• 4.2 材料與方法85-87
• 4.2.1 儀器與試劑85
• 4.2.2 材料85-86
• 4.2.3 a2催化合成磷脂酰絲氨酸86
• 4.2.4 磷脂酰絲氨酸檢測(cè)86
• 4.2.5 a2 PLD純化86
• 4.2.6 磷脂酶D水解活力測(cè)定86
• 4.2.7 蛋白質(zhì)含量測(cè)定86-87
• 4.2.8 SDS-PAGE電泳87
• 4.3 結(jié)果與討論87-89
• 4.3.1 a2 PLD催化合成PS87-88
• 4.3.2 a2 PLD純化88-89
• 4.4 本章小結(jié)89-90
• 5 總結(jié)與展望90-95
• 5.1 引言90-91
• 5.2 總結(jié)91-92
• 5.3 本論文的不足92-93
• 5.4 展望93-95
• 參考文獻(xiàn)95-102
• 致謝102-103
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷103

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  本文關(guān)鍵詞：微生物脂肪酶庫構(gòu)建及磷脂酶D的篩選與應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：328749