植植物遭受逆境會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量蛋白無(wú)法折疊或錯(cuò)誤折疊,從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫（ER stress）,此時(shí)細(xì)胞會(huì)通過(guò)啟動(dòng)未折疊蛋白應(yīng)答途徑（unfolded protein response,UPR）幫助蛋白折疊以緩解脅迫,而在這個(gè)途徑中膜結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子（membrane-associated transcription factor,MTF）發(fā)揮極其重要的作用。擬南芥中,已研究出NAC家族中的062、089、103都參與到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫途徑,通過(guò)調(diào)節(jié)下游基因來(lái)控制植物生命活動(dòng)。在本研究鑒定了一個(gè)質(zhì)膜相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子AtNAC091（也稱為TIP）,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫及其他非生物途徑中也起著重要作用。在本論文中,1)首先用qRT-PCR分析NAC091在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫下表達(dá)情況,確定NAC091受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫誘導(dǎo)上調(diào);2)NAC091受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫上調(diào)依賴于bZIP60,同時(shí)發(fā)現(xiàn)NAC091啟動(dòng)子序列上有一段經(jīng)典的ERSE-I元件,該元件是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫途徑中的經(jīng)典元件,進(jìn)一步說(shuō)明NAC091參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫途徑;3)運(yùn)用酵母雙雜交及BiFC技術(shù),發(fā)現(xiàn)NAC091具有轉(zhuǎn)錄激活活性和形成同源二聚體;4)利用激光共聚焦顯... 

【文章來(lái)源】：貴州師范大學(xué)貴州省

【文章頁(yè)數(shù)】：92 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

NAC蛋白的結(jié)構(gòu)模式圖(Ookaetal.,2003)

353.1NAC091在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫誘導(dǎo)劑作用下表達(dá)上調(diào)TM、DTT是能夠引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生脅迫的化學(xué)物質(zhì)，通過(guò)添加其中的某一種來(lái)模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)遭受脅迫的環(huán)境。為了判斷NAC091是否會(huì)參與到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫途徑中？首先分別用TM(5μg/mL)和DTT(2mM)對(duì)生長(zhǎng)10d的野生型擬南芥幼苗處理4h，并用DMSO處理的幼苗作為空白對(duì)照，然后分別對(duì)處理后的植株幼苗進(jìn)行RNA的提取，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用qRT-PCR檢測(cè)NAC091在不同處理下的表達(dá)差異（圖2），與對(duì)照組(DMSO)相比較NAC091在TM和DTT處理4h的樣品中，其表達(dá)量分別上調(diào)3.431和5.4倍，說(shuō)明NAC091在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫途徑中表達(dá)量能夠上調(diào)的。圖2NAC091在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫誘導(dǎo)劑處理下的表達(dá)分析用5μg/mL的TM和2mM的DTT處理WT幼苗4h（實(shí)驗(yàn)組），以及用DMSO處理4h（對(duì)照組）后樣品進(jìn)行qRT-PCR分析，相對(duì)基因表達(dá)量是表達(dá)NAC091在處理樣品與未處理樣品中表達(dá)量的差異。樣品中NAC091表達(dá)量已通過(guò)Actin進(jìn)行校正，**P<0.01，*P<0.05。3.2NAC091的誘導(dǎo)表達(dá)受到bZIP60的直接調(diào)控?fù)?jù)目前已有的研究，在擬南芥中參與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊應(yīng)答途徑中主要是bZIP28、bZIP60這兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；而且根據(jù)Sun、Yang等研究報(bào)道稱NAC家族中NAC103、NAC062啟動(dòng)子序列上存在的TCATCG順式元件能夠與bZIP60結(jié)合，進(jìn)一步說(shuō)明bZIP類轉(zhuǎn)錄因子會(huì)參與調(diào)控NAC蛋白的表達(dá)。為了分析出NAC091的表達(dá)上調(diào)與bZIP28、bZIP60之間是否存在關(guān)聯(lián)，本論文中用bzip28、bzip60單突變體(Sunetal.,2013)和WT野生型10d的幼苗，用5μg/mL的TM對(duì)以上3種不同的樣品進(jìn)行處理4h，并用DMSO處理的幼苗作為空白對(duì)照，然后

36分別對(duì)處理后的植株幼苗進(jìn)行RNA的提取，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再利用qRT-PCR分析這3種不同樣品中NAC091的表達(dá)量。與對(duì)照進(jìn)行比較，TM處理后在WT植株中NAC091的表達(dá)量上調(diào)約5倍；而TM處理后在bzip28單突變體植株中NAC091的表達(dá)量還是有所上調(diào)，只是其表達(dá)量與WT植株對(duì)比要低些，說(shuō)明敲除bZIP28對(duì)NAC091的表達(dá)無(wú)影響，也進(jìn)一步說(shuō)NAC091的表達(dá)不受bZIP28調(diào)控；而在bzip60單突變體植株中，TM處理后NAC091的表達(dá)量不上調(diào)，且與DMSO對(duì)照組表達(dá)量相比毫無(wú)差異，說(shuō)明NAC091在TM處理下，其表達(dá)受到bZIP60敲除的影響，也證實(shí)了NAC091的表達(dá)是依賴于bZIP60調(diào)控的（圖3）；同時(shí)，對(duì)NAC091啟動(dòng)子序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在該段序列上存在一個(gè)經(jīng)典的ERSE-Ⅰ元件CGAAT…CACG（圖4），以上實(shí)驗(yàn)充分說(shuō)明了NAC091能夠參與到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫途徑中來(lái)，并且受到bZIP60的調(diào)控。圖3在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫誘導(dǎo)下，WT、bzip28、bzip60中NAC091的表達(dá)用5μg/mL的TM（實(shí)驗(yàn)組）及相應(yīng)濃度的DMSO（對(duì)照組）處理WT野生型、bzip28、bzip60單突變體幼苗4h，然后對(duì)處理后的幼苗進(jìn)行RNA提娶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA來(lái)進(jìn)行qRT-PCR分析，相對(duì)基因表達(dá)量是不同樣品中NAC091的表達(dá)差異。樣品中NAC091表達(dá)量已通過(guò)Actin進(jìn)行校正，**P<0.01，*P<0.05。圖4NAC091啟動(dòng)子序列上存在ERSE-Ⅰ元件

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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