本文關(guān)鍵詞：雞傳染性支氣管炎病毒IgY抗體基因的擴增及表達，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本研究旨在利用基因工程抗體技術(shù)制備雞傳染性支氣管炎IgY抗體,為雞抗體基因的研究和特異性抗體的制備提供相關(guān)數(shù)據(jù),同時也為雞傳染性支氣管炎的治療及診斷提供幫助。為了擴增雞IgY抗體基因全長序列,本試驗首先提取雞脾臟總RNA,然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照NCBI上公布的雞輕鏈抗體基因序列合成特異引物,利用PCR技術(shù)擴增出輕鏈ORF序列。由于網(wǎng)上沒有公布出雞IgY抗體基因的重鏈全長序列,因此我們根據(jù)已公布出的重鏈恒定區(qū)序列設(shè)計引物分別利用5'RACE和3'RACE萬法擴增后測序驗證,將驗證正確的兩段序列通過DNAStar軟件拼接后找到ORF序列,再次設(shè)計引物利用重疊PCR方法擴增出重鏈ORF序列。將輕、重鏈擴增出的目的條帶分別連接到克隆載體上,經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5a后,選取單菌落搖菌抽取質(zhì)粒,經(jīng)酶切和PCR雙重驗證正確的質(zhì)粒送往公司測序。序列結(jié)果顯示擴增出的輕鏈ORF序列長705bp,編碼234個氨基酸與已公布的序列同源性達到95%；重鏈ORF序列長1716bp,編碼571個氨基酸,其可變區(qū)基因序列符合雞抗體重鏈可變區(qū)基因特征,其恒定區(qū)序列與已公布的雞IgY抗體基因重鏈序列同源性達到99%。說明我們己成功構(gòu)建擴增雞IgY抗體基因輕、重鏈序列的方法。為了表達雞IBV特異性抗體基因序列,首先將30只1日齡雛雞隨機分成2組,分別飼養(yǎng)在隔離的動物房中。待母源抗體水平下降后,第一組用弱毒疫苗株4/91進行免疫,14天后進行2免,第二組作為空白組不做處理。一免后每隔7天采集兩組血樣分離血清,間接ELISA法檢測特異性抗體,待抗體水平明顯升高時采集兩組雞脾臟,提取總RNA,擴增抗體基因。發(fā)現(xiàn)輕鏈可變區(qū)之間的變異非常大,而重鏈變異較小。從免疫雞中挑選出一條抗體基因?qū)⑵涠ㄏ蚩寺∪氡磉_載體pcDNA3.1中,構(gòu)建重組表達載體pcDNA3.1-H和pcDNA3.1-L。將測序正確的兩種重組載體共轉(zhuǎn)染293T細胞,然后利用間接免疫熒光、RT-PCR、間接ELISA等檢測方法對目的蛋白的表達及其特異性進行檢測。間接免疫熒光結(jié)果顯示在分別轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染的細胞中均可見綠色熒光,而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染的細胞中未檢測到綠色熒光RT-PCR檢測,在共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-H和pcDNA3.1-L的細胞中擴增出目的基因,而轉(zhuǎn)染空載體的細胞中未得到相應(yīng)的目的產(chǎn)物；間接ELISA結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細胞上清能與IBV的雞胚尿囊液發(fā)生特異性結(jié)合,與NDV、H5、H9和陰性尿囊液均無特異性反應(yīng)；而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染的細胞上清均無特異性反應(yīng)。說明我們成功表達出針對IBV特異性的抗體。綜上所訴,本試驗成功構(gòu)建一種快速擴增雞IgY抗體基因的方法,并利用該方法對擴增出的大量抗體基因進行分析研究,為雞源性抗體庫的構(gòu)建及特異性抗體基因的篩選提供指導(dǎo)；從免疫雞IBV弱毒疫苗株的雞脾臟中擴增出全長抗體基因,通過將其定向克隆入真核表達載體pcDNA3.1中,構(gòu)建了帶有組氨酸標簽的雞IgY抗體基因重鏈和輕鏈表達質(zhì)粒,并成功實現(xiàn)了在293T細胞中的表達,這對利用基因工程抗體技術(shù)獲得完整的特異性抗體分子的研究打下了基礎(chǔ),為后續(xù)大量生產(chǎn)IBV特異性單抗,克服傳統(tǒng)方法生產(chǎn)單抗費時費力及抗體中含有鼠源成分等缺點提供新思路。
【關(guān)鍵詞】：IBV IgY 克隆 真核表達
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 英文縮略詞對照表8-14
• 第一部分 文獻綜述和選題目的以及意義14-26
• 1 雞傳染性支氣管炎概述14-17
• 1.1 IBV病毒特征14-15
• 1.2 雞傳染性支氣管炎的危害15-16
• 1.3 雞傳染性支氣管炎的防治16-17
• 2 基因工程抗體研究進展17-22
• 2.1 基因工程抗體簡介17-18
• 2.2 基因工程抗體表達系統(tǒng)介紹18-20
• 2.2.1 大腸桿菌表達系統(tǒng)18-19
• 2.2.2 酵母表達系統(tǒng)19
• 2.2.3 昆蟲細胞表達系統(tǒng)19-20
• 2.2.4 植物表達系統(tǒng)20
• 2.2.5 哺乳類細胞表達系統(tǒng)20
• 2.3 基因工程抗體在雞抗體基因方面的相關(guān)研究20-22
• 3 RACE技術(shù)研究進展22-25
• 3.1 RACE的原理和方法22-23
• 3.2 幾種改進的RACE技術(shù)23-25
• 3.3 RACE成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)25
• 4 研究目的及意義25-26
• 第二部分 實驗內(nèi)容26-58
• 第一章 雞IGY抗體基因的擴增26-42
• 1 實驗材料26-27
• 1.1 實驗動物26
• 1.2 主要生物試劑26
• 1.3 主要實驗器材26-27
• 1.4 常用試劑的配制27
• 2 實驗方法27-37
• 2.1 樣品的制備27-28
• 2.2 總RNA的提取28-29
• 2.3 雞抗體基因重鏈IgY全長序列的獲得29-35
• 2.3.1 重鏈基因5'端序列的獲得(5'RACE)29-32
• 2.3.2 重鏈IgY基因3'端序列的獲得(3'RACE)32-33
• 2.3.3 重鏈IgY全長序列的拼接33-35
• 2.4 雞抗體基因輕鏈全長序列的擴增及分析35-37
• 2.4.1 引物設(shè)計35
• 2.4.2 反轉(zhuǎn)錄35-36
• 2.4.3 PCR擴增36
• 2.4.4 序列測定及分析36-37
• 3 實驗結(jié)果37-41
• 3.1 雞IgY重鏈5'RACE、3'RACE及全長序列擴增結(jié)果37
• 3.2 雞IgY重鏈基因序列分析37-39
• 3.2.1 5'RACE序列分析37-39
• 3.2.2 3'RACE序列分析39
• 3.2.3 重鏈全長序列分析39
• 3.3 雞輕鏈全長序列擴增結(jié)果39-40
• 3.4 雞輕鏈IgL基因序列分析40-41
• 4 討論41-42
• 第二章 抗雞IBV特異性IGY抗體真核表達載體的構(gòu)建及表達檢測42-58
• 1 材料與方法42-45
• 1.1 實驗動物及雞胚42
• 1.2 質(zhì)粒、疫苗株和細胞42-43
• 1.3 主要生物試劑43
• 1.4 主要實驗器材43
• 1.5 常用試劑的配制43-45
• 2 實驗方法45-51
• 2.1 雞胚接種45
• 2.2 EID50測定45
• 2.3 動物實驗45-46
• 2.4 抗體基因的擴增及測序46-47
• 2.4.1 引物設(shè)計46
• 2.4.2 PCR擴增46
• 2.4.3 測序分析46-47
• 2.5 重組真核表達載體的構(gòu)建47-48
• 2.5.1 重組質(zhì)粒和載體的雙酶切47
• 2.5.2 目的片段與pcDNA3.1(+)載體的連接轉(zhuǎn)化47-48
• 2.5.3 無內(nèi)毒素質(zhì)粒的提取及鑒定48
• 2.5.4 質(zhì)粒DNA的濃度測定48
• 2.6 重組真核質(zhì)粒的表達48-50
• 2.6.1 293T細胞的復(fù)蘇48-49
• 2.6.2 293T細胞的傳代培養(yǎng)49
• 2.6.3 細胞轉(zhuǎn)染49-50
• 2.7 重組真核質(zhì)粒的表達鑒定50-51
• 2.7.1 間接免疫熒光檢測蛋白的表達50
• 2.7.2 RT-PCR檢測50
• 2.7.3 間接ELISA檢測50-51
• 3 實驗結(jié)果51-56
• 3.1 EID50測定結(jié)果51
• 3.2 動物實驗結(jié)果51-52
• 3.3 序列擴增結(jié)果52
• 3.4 序列分析結(jié)果52-53
• 3.5 重組載體雙酶切和測序結(jié)果53-54
• 3.6 表達蛋白檢測結(jié)果54-56
• 3.6.1 間接免疫熒光染色鑒定雞抗體基因的表達54-55
• 3.6.2 RT-PCR檢測結(jié)果55-56
• 3.6.3 間接ELISA檢測結(jié)果56
• 4 討論56-58
• 結(jié)論58-59
• 參考文獻59-66
• 致謝66

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本文編號：325562