本文關(guān)鍵詞：鴨坦布蘇病毒的分離、鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本研究從西南地區(qū)的某鴨養(yǎng)殖場(chǎng)無(wú)菌采集有疑似坦布蘇病毒(Tembusu virus, TMUV)癥狀的病鴨肝臟組織,開(kāi)展了以下研究：疑似病毒的分離、鑒定；TMUV對(duì)鴨胚成纖維細(xì)胞及雛鴨的致病性試驗(yàn)；TMUV的全基因組序列的擴(kuò)增、遺傳進(jìn)化分析。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：1.疑似病毒的分離、鑒定：采集的病料組織經(jīng)剪碎、研磨、離心、過(guò)濾除菌后,接種于9日齡健康鴨胚并收集尿囊液按照常規(guī)病毒分離方法進(jìn)行盲傳。該病毒在鴨胚傳代過(guò)程中,自盲傳至3代以后,病毒液可導(dǎo)致鴨胚于3-4d內(nèi)死亡,并致使鴨胚胚體水腫、出血,胚肝水腫、壞死。經(jīng)鑒定,病毒的核酸類型為RNA,病毒為有囊膜病毒,不耐酸,對(duì)氯仿、乙醚等有機(jī)溶劑敏感,符合黃病毒成員的基本生物學(xué)特征。對(duì)收集的尿囊液經(jīng)PCR或RT-PCR檢測(cè),其他幾種常見(jiàn)鴨源病原如鴨瘟病毒(Duck plague virus, DP V)、鴨圓環(huán)病毒(Duck circovirus, DuCV)、鴨乙型肝炎病毒(Duck Hepatitis B Virus, DHBV)、鴨源禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)檢測(cè)為陰性。根據(jù)TMUV-WR株NS3-NS4片段保守序列設(shè)計(jì)的特異性引物通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增出疑似目的條帶(1250 bp),經(jīng)測(cè)序、比對(duì)后發(fā)現(xiàn),與已公布的黃病毒科黃病毒屬恩他耶病毒IPDIA分離株核苷酸(GenBank NO:NC_018705)相似性為72.3%,與國(guó)內(nèi)己公布的TMUV分離株相比,同GX2013H株(GenBank NO:KJ700462)相似性最高,為99.4%,同1q-1株(GenBank NO:KF557893)相似性最低,為96.8%。綜上所述,我們初步分離得到一株源于西南地區(qū)的鴨源坦布蘇病毒,將其命名為CQW1。2. TMUV-CQW1株對(duì)鴨胚成纖維細(xì)胞及雛鴨的致病性試驗(yàn)：以鴨胚傳代至第五代病毒液為母液,接種于單層致密的鴨胚成纖維細(xì)胞孵育,培養(yǎng),觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn),攻毒后24 h細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)圓縮,48 h圓縮的細(xì)胞增多,72 h細(xì)胞內(nèi)空泡串聯(lián)形成較大空泡,細(xì)胞脫落死亡。表明CQW1可在鴨胚成纖維細(xì)胞上進(jìn)行培養(yǎng)增殖,并可以引起明顯的細(xì)胞病變。經(jīng)測(cè)定,獲取的病毒液滴度為105.5 TCID50/0.05 mL。選取20只7日齡櫻桃谷雛鴨進(jìn)行了動(dòng)物回歸試驗(yàn),其中10只通過(guò)頸靜脈注射0.2 mL(含102.75 ELD50)病毒液作為攻毒組,10只通過(guò)注射等量PBS溶液分籠飼養(yǎng)作為陰性對(duì)照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn),雛鴨攻毒后出現(xiàn)明顯的食欲下降、不愿走動(dòng),精神萎靡、共濟(jì)失調(diào),死亡時(shí)呈角弓反張等神經(jīng)癥狀。攻毒組共10只發(fā)病,發(fā)病率為100%,6只于攻毒后自然死亡,死亡率為60%；對(duì)照組無(wú)明顯臨床癥狀。動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果表明,CQW1株能夠引起雛鴨死亡,死亡率可達(dá)60%。 RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),能夠從病鴨的血液、肝臟、大腦組織中檢測(cè)到TMUV。病理學(xué)觀察結(jié)果表明,CQW1株可導(dǎo)致腦膜血管充血、脫落,同時(shí)引起大腦組織神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生,大量神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞趨向壞死的神經(jīng)元細(xì)胞,形成明顯的“噬神經(jīng)元現(xiàn)象”。另外可導(dǎo)致病鴨肝臟出血、淤血,大量肝細(xì)胞變性、壞死,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,同時(shí)存在有較多新生肝細(xì)胞。3. TMUV-CQW1株的全基因組序列的擴(kuò)增及遺傳進(jìn)化分析：通過(guò)設(shè)計(jì)相互覆蓋TMUV cDNA全長(zhǎng)的引物,分段擴(kuò)增、測(cè)序、拼接獲得了CQW1株全長(zhǎng)基因組序列(GenBank NO. KM233707)。全基因組序列分析結(jié)果表明,CQW1株全長(zhǎng)10992 nt,含有一個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF),編碼一個(gè)長(zhǎng)為2625 aa的多聚蛋白,預(yù)測(cè)的多聚蛋白切割位點(diǎn)與其他TMUV成員一致,共編碼10個(gè)功能蛋白。黃病毒代表成員以及坦布蘇病毒分離株的進(jìn)化樹(shù)分析表明,CQW1株屬于黃病毒屬恩他耶家族成員,CQW1與其他TMUV成員在全基因組核苷酸和氨基酸相似性分別為96.8%-99.1%,98.4%-99.6%,與廣西株GX2013H親緣關(guān)系最近,兩者夠成了一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分枝。與國(guó)內(nèi)其他分離株相比,CQW1同其他分離株的平均進(jìn)化距離(0.0299)高于其他毒株之間的平均進(jìn)化距離(0.0163),表明CQW1株同其他分離株相比,有一定的地域差異。選取34條TMUVE基因按照不同年份分組進(jìn)行分子變異分析,結(jié)果表明,TMUV的E基因遺傳多樣性隨時(shí)間變化明顯,且在2010-2013年之間以平均3.8×10-3/年的速率多樣化,多樣化速率相對(duì)其他黃病毒成員較快。另外,各年份之間以2010年遺傳分化率最低,2011-2012相對(duì)平穩(wěn),而2013年的遺傳分化率最高,顯示出了該病毒在2010-2013年的遺傳分化特征。
【關(guān)鍵詞】：鴨坦布蘇病毒 西南地區(qū) 分離鑒定 進(jìn)化分析
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 縮略詞表7-11
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述及選題背景11-16
• 第一章 坦布蘇病毒研究進(jìn)展11-16
• 1 坦布蘇病毒病原分類地位11
• 2 TMUV的生物學(xué)特征11-13
• 3 TMUV的致病性13-14
• 4 TMUV的流行病學(xué)特征14-15
• 5 本研究的選題背景15-16
• 第二部分 試驗(yàn)研究16-47
• 第二章 鴨坦布蘇病毒的分離鑒定16-36
• 1 實(shí)驗(yàn)材料16-19
• 1.1 病料來(lái)源16
• 1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物16
• 1.3 分子生物學(xué)試劑16-17
• 1.4 主要試劑及配制17-18
• 1.5 主要儀器18-19
• 2 實(shí)驗(yàn)方法19-25
• 2.1 病毒的分離及傳鴨胚代19-20
• 2.1.1 組織采集及處理19
• 2.1.2 病原體的鴨胚分離及傳代19-20
• 2.2 病原的RT-PCR或PCR檢測(cè)20-22
• 2.2.1 病原總RNA提取20
• 2.2.2 cDNA的合成20
• 2.2.3 病原總DNA的提取20-21
• 2.2.4 PCR及RT-PCR檢測(cè)21-22
• 2.3 病毒理化性質(zhì)鑒定22
• 2.3.1 病毒核酸類型鑒定22
• 2.3.2 脂溶劑敏感性試驗(yàn)22
• 2.3.3 耐酸性試驗(yàn)22
• 2.3.4 胰蛋白酶敏感性試驗(yàn)22
• 2.4 病毒的DEF細(xì)胞培養(yǎng)特性22-23
• 2.5 病毒毒力測(cè)定23-24
• 2.5.1 TCID_(50)的測(cè)定23
• 2.5.2 ELD_(50)的測(cè)定23-24
• 2.6 動(dòng)物回歸試驗(yàn)24
• 2.7 病理組織切片觀察24-25
• 2.7.1 玻片和蓋玻片的處理24
• 2.7.2 病理組織切片制作24-25
• 3 試驗(yàn)結(jié)果25-33
• 3.1 病毒的傳代分離結(jié)果25-26
• 3.2 病原RT-PCR檢測(cè)結(jié)果26-27
• 3.3 病毒理化性質(zhì)鑒定27-28
• 3.3.1 核酸類型鑒定結(jié)果27
• 3.3.2 脂溶劑敏感性試驗(yàn)結(jié)果27
• 3.3.3 耐酸性試驗(yàn)結(jié)果27-28
• 3.3.4 胰蛋白酶敏感性試驗(yàn)結(jié)果28
• 3.4 CQW1的DEF細(xì)胞培養(yǎng)特性28-29
• 3.5 病毒毒力測(cè)定29-30
• 3.5.1 TCID_(50)的測(cè)定29
• 3.5.2 ELD_(50)的測(cè)定29-30
• 3.6 動(dòng)物回歸試驗(yàn)30-32
• 3.7 病理組織切片觀察32-33
• 4 討論與分析33-35
• 5 本章小結(jié)35-36
• 第三章 TMUV西南株CQW1全基因組序列測(cè)定及遺傳進(jìn)化分析36-47
• 1 試驗(yàn)材料36
• 1.1 毒株及其序列來(lái)源36
• 1.2 主要儀器設(shè)備36
• 1.3 操作系統(tǒng)及分析軟件36
• 1.4 主要分子生物學(xué)試劑耗材36
• 2 試驗(yàn)方法36-40
• 2.1 引物設(shè)計(jì)36-37
• 2.2 全基因組序列測(cè)定37-38
• 2.2.1 總RNA的抽提37
• 2.2.2 全基因組的RT-PCR擴(kuò)增37
• 2.2.3 基因組序列的拼接37-38
• 2.3 基因組結(jié)構(gòu)特征分析38
• 2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析38-40
• 2.4.1 全基因組序列分析38-40
• 2.4.2 E基因序列遺傳變異分析40
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-45
• 3.1 引物設(shè)計(jì)40-41
• 3.2 全基因組序列測(cè)定41
• 3.3 基因組結(jié)構(gòu)特征分析41-42
• 3.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析42-45
• 3.4.1 全基因組序列分析42-44
• 3.4.2 E基因序列遺傳變異分析44-45
• 4 討論與分析45-46
• 5 本章小結(jié)46-47
• 參考文獻(xiàn)47-55
• 致謝55-56
• 附錄：CQW1株全基因組序列56-60
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄60

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