NrgA是定位于細(xì)胞膜上的高親和力銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在生命的所有領(lǐng)域都是保守的,負(fù)責(zé)銨離子在膜上的運(yùn)輸,并且僅在銨離子濃度低時(shí)起作用。NrgA基因突變會導(dǎo)致其銨離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力減弱或喪失,因此研究認(rèn)為NrgA對于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)是不可或缺的。實(shí)驗(yàn)室之前的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)顯示,在多粘類芽孢桿菌SC2-M1中,NrgA基因可能與抗生素合成有關(guān)。本研究利用同源重組的方法在多粘類芽孢桿菌SC2-M1中對NrgA基因進(jìn)行敲除,結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)進(jìn)一步探究了NrgA在多粘類芽孢桿菌中的功能。與野生型SC2-M1相比,突變菌株的銨離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力明顯減弱,鞭毛及其運(yùn)動性喪失,拮抗細(xì)菌性能增強(qiáng)。通過4D LFQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)檢測野生株SC2-M1和突變株NrgA-q的差異表達(dá)蛋白,共鑒定得到20個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì),其中13個(gè)蛋白上調(diào),7個(gè)蛋白下調(diào)。對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行功能分類,發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白主要集中于多種物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過程,其中包括氨基酸、核苷酸、碳水化合物、輔酶、脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等。差異蛋白代謝通路富集分析發(fā)現(xiàn)NrgA與嘌呤代謝途徑和亞精胺/鳥氨酸代謝途徑密切相關(guān),NrgA可能通過影響銨離子的轉(zhuǎn)運(yùn),使p... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
符號說明
中文摘要
Abstract
1 引言
    1.1 植物根際促生細(xì)菌(PGPR)
    1.2 多粘類芽孢桿菌概述
        1.2.1 多粘類芽孢桿菌起源及菌種特性
        1.2.2 多粘類芽孢桿菌促生機(jī)理及應(yīng)用
        1.2.3 多粘類芽孢桿菌SC2及SC2-M1
    1.3 NrgA基因及Nrg A銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白
    1.4 細(xì)菌鞭毛及其運(yùn)動性
    1.5 嘌呤代謝調(diào)控通路
    1.6 蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用
    1.7 代謝組學(xué)的應(yīng)用
    1.8 研究目的、研究內(nèi)容和技術(shù)路線
        1.8.1 研究目的
        1.8.2 研究內(nèi)容
        1.8.3 技術(shù)路線
2 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 培養(yǎng)基與溶液
        2.1.3 酶和試劑
        2.1.4 儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 構(gòu)建基因敲除菌株
            2.2.1.1 多粘類芽孢桿菌SC2-M1 基因組DNA的提取
            2.2.1.2 引物設(shè)計(jì)
            2.2.1.3 PCR擴(kuò)增目的片段
            2.2.1.4 PCR產(chǎn)物膠回收
            2.2.1.5 連接克隆載體
            2.2.1.6 轉(zhuǎn)化大腸桿菌
            2.2.1.7 質(zhì)粒提取
            2.2.1.8 酶切和連接表達(dá)載體
            2.2.1.9 多粘類芽孢桿菌SC2-M1 感受態(tài)的制備
            2.2.1.10 多粘類芽孢桿菌SC2-M1 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過程(電轉(zhuǎn)化法)
            2.2.1.11 基因敲除菌株的篩選
        2.2.2 RNA的提取
        2.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)
        2.2.4 生長曲線測定
        2.2.5 鞭毛觀察(電鏡觀察法)
        2.2.6 運(yùn)動性檢測
        2.2.7 拮抗性檢測
        2.2.8 蛋白質(zhì)組學(xué)
            2.2.8.1 蛋白提取
            2.2.8.2 胰酶酶解
            2.2.8.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析
            2.2.8.4 數(shù)據(jù)庫搜索
            2.2.8.5 質(zhì)譜質(zhì)控檢測
            2.2.8.6 差異表達(dá)蛋白的篩選
            2.2.8.7 生物信息學(xué)分析
        2.2.9 代謝組學(xué)
            2.2.9.1 代謝物提取
            2.2.9.2 LC-MS/MS分析
            2.2.9.3 數(shù)據(jù)預(yù)處理和質(zhì)控
            2.2.9.4 化合物檢測和注釋
            2.2.9.5 統(tǒng)計(jì)分析及差異代謝物的篩選
            2.2.9.6 差異代謝物分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 多粘類芽孢桿菌SC2-M1 菌株NrgA基因功能分析
        3.1.1 多粘類芽孢桿菌SC2-M1 菌株NrgA基因氨基酸序列比對分析
        3.1.2 構(gòu)建多粘類芽孢桿菌NrgA基因敲除菌株
        3.1.3 多粘類芽孢桿菌NrgA基因敲除菌株(Nrg A-q)的表型分析
            3.1.3.1 生長曲線
            3.1.3.2 細(xì)菌拮抗
            3.1.3.3 鞭毛及運(yùn)動性觀察
        3.1.4 多粘類芽孢桿菌NrgA基因敲除菌株(Nrg A-q)的相關(guān)基因定量分析
    3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果
        3.2.1 差異表達(dá)蛋白的篩選
        3.2.2 差異表達(dá)蛋白的功能分類
            3.2.2.1 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位分類
            3.2.2.2 GO二級分類
            3.2.2.3 COG功能分類
        3.2.3 差異表達(dá)蛋白代謝通路富集分析
        3.2.4 差異表達(dá)蛋白互作分析
        3.2.5 相關(guān)差異表達(dá)蛋白分析
        3.2.6 鞭毛及運(yùn)動性相關(guān)分析
    3.3 代謝組學(xué)分析結(jié)果
        3.3.1 代謝物檢測和鑒定情況
        3.3.2 差異代謝物的篩選和聚類分析
        3.3.3 差異代謝物代謝通路富集分析
        3.3.4 拮抗性相關(guān)分析
    3.4 蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合分析結(jié)果
        3.4.1 通路富集分析
        3.4.2 多粘類芽孢桿菌SC2-M1中NrgA相關(guān)功能路線
4 討論
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[5]多粘類芽孢桿菌研究進(jìn)展[J]. 田宇曦,閔勇,楊自文,王開梅.  湖北農(nóng)業(yè)科學(xué). 2017(18)
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博士論文
[1]多粘類芽孢桿菌SC2形態(tài)分化的分子機(jī)制研究[D]. 侯曉陽.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015

碩士論文
[1]多粘類芽胞桿菌（Paenibacillus polymyxa）SC2基因敲除體系的建立[D]. 張文娣.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[2]多粘類芽孢桿菌SC2的全基因組測序[D]. 王翠翠.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[3]辣椒根際拮抗菌篩選、鑒定及多粘類芽孢桿菌SC2拮抗相關(guān)基因克隆[D]. 朱輝.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008
[4]鞭毛細(xì)菌游動機(jī)理及其模型研究[D]. 崔俊文.上海交通大學(xué) 2007



本文編號：3192482