發(fā)布時間：2021-03-31 02:50

　　長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）是一類長度大于200個核酸且不編碼蛋白質(zhì)的RNA。盡管lncRNA被報道參與了諸多生物學過程,其生物學意義和分子機制仍不十分清晰,并且存在諸多爭議。反向遺傳學技術(shù)是揭示lncRNA生物學功能的重要研究手段,然而眾多相關(guān)研究表明現(xiàn)有的研究技術(shù)通常具有較高的非特異性作用和脫靶效應(yīng),或無法準確判斷表型變化是否由轉(zhuǎn)錄本導致。除了技術(shù)上的限制,lncRNA本身特征,如與功能元件重疊、尚不明確的作用機制、可變剪切、核定位和豐度低等,都使其功能研究充滿挑戰(zhàn)。本課題研究一類新型lncRNA,極長基因間非編碼RNA（very long intergenic non-coding RNAs,vlincRNAs）,應(yīng)用最新的反向遺傳學技術(shù)CRISPR/Cas13系統(tǒng),對vlincRNA進行功能鑒定。該方法具有比其他現(xiàn)有方法（如RNAi）更高的特異性,并且靶向RNA而非DNA（如CRISPR/Cas9系統(tǒng)）,于是可以準確地將表型分配給轉(zhuǎn)錄本。生存篩選是指抗癌藥物作用于癌細胞造成壓力使細胞傷亡或存活的過程。本課題將CRISPR/Cas13系... 

【文章來源】：華僑大學福建省

【文章頁數(shù)】：89 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

靶向不同對象的反向遺傳學技術(shù)

第2章基礎(chǔ)實驗材料與方法11圖2.1Cas13質(zhì)粒和gRNA質(zhì)粒示意圖人類慢性髓系白血病細胞K562（中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫），是一種懸浮細胞，已經(jīng)有研究表明，K562細胞系是常見細胞系中vlincRNA含量較多的一種[22]，這使得K562細胞系非常適合用于研究vlincRNA。本課題的所有改造細胞系都是由K562細胞改造獲得。2.1.2藥物本課題選擇了三種抗腫瘤藥物，分別是依托泊苷（Etoposide，AbMoleBioScience，美國），拓撲異構(gòu)酶II抑制劑，可誘導DNA損傷，固體粉末，溶于DMSO，保存于-20℃。米林（Mirin，AbMoleBioScience，美國），是DNA雙鏈斷裂感應(yīng)因子MRE11A的抑制劑，固體粉末，溶于DMSO，保存于-20℃。伊馬替尼（Imatinib，AbMoleBioScience，美國），K562的癌基因BCR-ABL的抑制劑，固體粉末，溶于DMSO，保存于-20℃。這三種抗腫瘤藥物將會作為接下來篩選研究vlincRNA以及生存篩選實驗的壓力來源。Etoposide在臨床上以用于治療包括白血病的多種癌癥[49]，并且在許多DNA損傷相關(guān)研究中作為DNA損傷誘導劑[48]，Imatinib是治療慢性骨髓性白血病的藥物，對由于染色體易位產(chǎn)生的費城染色體導而導致的慢性骨髓性白血病治療效果十分顯著[50]。盡管Mirin沒有在臨床上用于治療惡性腫瘤，但是，根據(jù)本實驗室的早期實驗數(shù)據(jù)，Mirin可以誘導K562細胞

第3章CRISPR/Cas13細胞文庫構(gòu)建21圖3.1Cas13mRNADox誘導表達倍數(shù)3.2篩選備選vlincRNA及mRNA3.2.1實驗設(shè)計為了選擇合適的研究對象vlincRNA，我們設(shè)計了如圖3.2所示的實驗流程。將K562細胞，用Etoposide、Mirin或Imatinib處理3小時和6小時，并且提取處理前后的總RNA，進行RNA-seq，根據(jù)RNA-seq數(shù)據(jù)的結(jié)果，篩選出合適的備選vlincRNA.


本文編號：3110636