本文關(guān)鍵詞：丙酮酸羧化酶在海洋解脂耶羅威亞酵母菌合成檸檬酸中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：檸檬酸是一種重要的有機(jī)酸,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥與工業(yè)領(lǐng)域。目前檸檬酸主要是通過生物發(fā)酵的方式獲得,其中黑曲霉是工業(yè)發(fā)酵的主要菌株。然而,黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的廢物易污染環(huán)境,并且發(fā)酵控制技術(shù)要求高,對(duì)菌株的遺傳改造難度也大。在檸檬酸的發(fā)酵生產(chǎn)中,解脂耶羅威亞酵母菌能夠克服黑曲霉生產(chǎn)中的不足,已經(jīng)成為近年來研究的熱點(diǎn),作為檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)菌株也逐漸被人們所認(rèn)同。在其他人的研究中發(fā)現(xiàn),丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase)在有機(jī)酸合成方面有著很大的作用。該酶催化丙酮酸形成草酰乙酸,在酵母油脂合成與琥珀酸、α-酮戊二酸以及蘋果酸等有機(jī)酸積累方面有著重要作用。檸檬酸是草酰乙酸與乙酰CoA通過縮合作用形成的,因此我們認(rèn)為丙酮酸羧化酶在檸檬酸合成中也起著某些重要作用。為了進(jìn)一步研究丙酮酸羧化酶在檸檬酸合成調(diào)控中的作用,本論文分別克隆了季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii) Pcla22菌株和海洋霉菌產(chǎn)紅青霉(Penicillium rubens) 1067菌株的丙酮酸羧化酶基因,并將這些基因在解脂耶羅威亞酵母(Yarrowia lipolytica) SWJ-1 b菌株中進(jìn)行了表達(dá)。pINA1312質(zhì)粒是適用于在解脂耶羅威亞酵母(Y.lipolytica)中高效表達(dá)外源基因的質(zhì)粒。但在實(shí)際應(yīng)用中,該質(zhì)粒由于多克隆位點(diǎn)區(qū)域可用的酶切位點(diǎn)過少,在表達(dá)外源基因的過程中受到了很大的限制。本研究采用引物人工退火與酶切連接的方法,成功構(gòu)建pINA1312-GY質(zhì)粒,在pINA1312質(zhì)粒上增加3個(gè)新的酶切位點(diǎn),為外源基因在Y. lipolytica中表達(dá)構(gòu)建了方便有效的工具。季也蒙畢赤酵母(P. guilliermondii是一株已全基因組測(cè)序的菌株,具有遺傳背景清楚和高產(chǎn)有機(jī)酸的優(yōu)點(diǎn)。將一株分離自海洋的季也蒙畢赤酵母Pcla22菌株的丙酮酸羧化酶基因(PYC)在解脂耶羅威亞酵母SWJ-1b菌株中進(jìn)行了表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)化子PG86的丙酮酸羧化酶酶活和檸檬酸產(chǎn)量都明顯高于原始菌株SWJ-1b。在補(bǔ)料發(fā)酵條件下,轉(zhuǎn)化子PG86的發(fā)酵液檸檬酸濃度為101.0士1.3g/l,糖轉(zhuǎn)化為檸檬酸的得率為0.89g/g。HPLC檢測(cè)表明發(fā)酵產(chǎn)物主要為檸檬酸。這表明丙酮酸羧化酶基因(PYC)得到了超表達(dá),且該酶在檸檬酸合成調(diào)控中具有重要作用,超表達(dá)丙酮酸羧化酶可以促進(jìn)檸檬酸的累積。海洋霉菌產(chǎn)紅青霉(P.rubens)是一株高產(chǎn)有機(jī)酸的菌株,目前對(duì)它的研究還很少。本實(shí)驗(yàn)采用簡(jiǎn)并引物和基因組步移的方法,克隆了產(chǎn)紅青霉(P.rubens)1067菌株的丙酮酸羧化酶基因及其上下游調(diào)控區(qū)基因。該菌丙酮酸羧化酶基因(登錄號(hào)：KM397349.1)ORF框共3534 bp,編碼1177個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)分子量為127.531kDa,等電點(diǎn)pI 6.20。啟動(dòng)子位于基因上游-1200 bp位置,包含一個(gè)TATAA框、多個(gè)CAAt框和5'-SYGGRG-3'序列。該酶無信號(hào)肽,為同源四聚體結(jié)構(gòu)(α4),每一單體包含四個(gè)功能區(qū)域。為了進(jìn)一步提高檸檬酸產(chǎn)量,將1607菌株的丙酮酸羧化酶基因(RPYC)在解脂耶羅威亞酵母SWJ-1b菌株中進(jìn)行表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)化子PR32的丙酮酸羧化酶酶活可達(dá)0.53 U/mg,高于相同條件下SWJ-1b菌株和PG86菌株的酶活(分別為0.07 U/mg和0.38U/mg)。測(cè)定了補(bǔ)料發(fā)酵條件下轉(zhuǎn)化子PR32菌株的產(chǎn)檸檬酸能力,發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液中檸檬酸濃度為111.1±1.3 g/l,糖轉(zhuǎn)化為檸檬酸的得率為0.93 g/g。進(jìn)一步表明,提高丙酮酸羧化酶酶活力,可以將更多的CO2固定到糖代謝中并生成更多的草酰乙酸,進(jìn)而草酰乙酸和乙酰CoA合成了更高水平的檸檬酸。
【關(guān)鍵詞】：解脂耶羅威亞酵母菌 檸檬酸 丙酮酸羧化酶 基因克隆 分批補(bǔ)料發(fā)酵
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q936
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 緒論12-32
• 1 檸檬酸12-20
• 1.1 檸檬酸的性質(zhì)及主要應(yīng)用12-13
• 1.2 檸檬酸的工業(yè)生產(chǎn)13
• 1.3 檸檬酸生產(chǎn)菌株13-18
• 1.4 檸檬酸的生物合成途徑18-20
• 2 丙酮酸羧化酶20-30
• 2.1 丙酮酸羧化酶的性質(zhì)及功能20
• 2.2 丙酮酸羧化酶的結(jié)構(gòu)特征20-21
• 2.3 丙酮酸羧化酶的作用機(jī)制21-22
• 2.4 丙酮酸羧化酶在有機(jī)酸代謝中的作用22-30
• 3 論文立項(xiàng)依據(jù)和研究?jī)?nèi)容30-32
• 第二章 pINA1312質(zhì)粒的改造32-38
• 1 前言32
• 2 材料與方法32-35
• 2.1 質(zhì)粒和菌株32
• 2.2 培養(yǎng)基與試劑32-33
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法33-35
• 3 結(jié)果與討論35-37
• 4 本章小結(jié)37-38
• 第三章 P.guilliermondii丙酮酸羧化酶基因在Y.lipolitica表達(dá)和檸檬酸的小規(guī)模生產(chǎn)38-57
• 1 前言38
• 2 材料與方法38-46
• 2.1 質(zhì)粒和菌株38-39
• 2.2 培養(yǎng)基與試劑39-40
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法40-46
• 3 結(jié)果與討論46-55
• 3.1 基因組DNA的提取46-47
• 3.2 P.guilliermondii丙酮酸羧化酶基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建47-48
• 3.3 轉(zhuǎn)化Y.lipolytica酵母細(xì)胞48-49
• 3.4 轉(zhuǎn)化子篩選驗(yàn)證49-51
• 3.5 丙酮酸羧化酶酶活及基因表達(dá)水平51-52
• 3.6 葡萄糖濃度的優(yōu)化52-53
• 3.7 補(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)53-54
• 3.8 發(fā)酵產(chǎn)物檢測(cè)54-55
• 4 本章小結(jié)55-57
• 第四章 P.rubens丙酮酸羧化酶的基因克隆及生物信息學(xué)分析57-70
• 1 前言57-58
• 2 材料與方法58-62
• 2.1 質(zhì)粒和菌株58
• 2.2 培養(yǎng)基與試劑58
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法58-62
• 3 結(jié)果與討論62-69
• 3.1 基因組DNA的提取62-63
• 3.2 簡(jiǎn)并引物PCR擴(kuò)增63
• 3.3 基因組步移技術(shù)獲得丙酮酸羧化酶基因全長(zhǎng)63-64
• 3.4 丙酮酸羧化酶基因蛋白序列生物信息學(xué)分析64-69
• 4 本章小結(jié)69-70
• 第五章 P.rubens丙酮酸羧化酶基因在Y.lipolitica中表達(dá)和檸檬酸的小規(guī)模生產(chǎn)70-84
• 1 前言70
• 2 材料與方法70-75
• 2.1 質(zhì)粒和菌株70-71
• 2.2 培養(yǎng)基與試劑71
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法71-75
• 3 結(jié)果與討論75-83
• 3.1 P.rubens丙酮酸羧化酶基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建75-77
• 3.2 轉(zhuǎn)化Y.lipolytica酵母細(xì)胞77-78
• 3.3 轉(zhuǎn)化子篩選驗(yàn)證78-79
• 3.4 丙酮酸羧化酶比酶活及基因表達(dá)水平79-81
• 3.5 葡萄糖濃度的優(yōu)化81-82
• 3.6 補(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)82-83
• 4 本章小結(jié)83-84
• 論文總結(jié)與創(chuàng)新點(diǎn)84-86
• 參考文獻(xiàn)86-98
• 附錄98-99
• 致謝99-100
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文100

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2 徐闖,夏成,劉國(guó)文,王哲,李家奎,張乃生,王興龍,歐陽紅生,張永亮;應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)PCR檢測(cè)丙酸鹽對(duì)體外培養(yǎng)牛肝細(xì)胞丙酮酸羧化酶mRNA水平的影響[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2005年04期

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本文編號(hào)：304806