本文關(guān)鍵詞：PEAR技術(shù)制備修飾性寡核苷酸及大腸桿菌移碼突變恢復(fù)相關(guān)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人工合成的寡核苷酸在基因調(diào)控方面有重要而廣泛的用途。一些寡核苷酸,例如反義寡核苷酸、CpG寡核苷酸和核酸適配體等已經(jīng)成功應(yīng)用于基因治療上。但是,大量制備寡核苷酸不僅困難而且花費(fèi)特別高。這不僅需要昂貴的合成儀器而且需要繁瑣的純化程序,因?yàn)榛瘜W(xué)合成的寡核苷酸含有大量的錯(cuò)誤序列。之前,本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了一種“聚合酶-內(nèi)切酶擴(kuò)增反應(yīng)”,可以用來(lái)制備非修飾性和硫代修飾性寡核苷酸。本文將這種技術(shù)延伸用于制備氟代修飾以及氟硫混合修飾寡核苷酸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,KOD DNA聚合酶和Phusion DNA聚合酶都可以用來(lái)擴(kuò)增含有一種或兩種修飾堿基的寡核苷酸,但是KOD DNA聚合酶在擴(kuò)增氟代和氟硫雙代寡核苷酸時(shí)更具優(yōu)勢(shì)。之后用質(zhì)譜檢測(cè)了PEAR產(chǎn)物成分,證明PEAR擴(kuò)增具有極高的準(zhǔn)確性。PEAR產(chǎn)物經(jīng)完全酶切,所有縮短了的產(chǎn)物量非常低(4.8%),全長(zhǎng)產(chǎn)物比例達(dá)到95.2%,全長(zhǎng)修飾性產(chǎn)物比例達(dá)到89.2%。PEAR反應(yīng)能有效地合成修飾性寡核苷酸。并且擁有諸多優(yōu)點(diǎn),例如：成本低、無(wú)污染、產(chǎn)物純度高、純化簡(jiǎn)單、容易擴(kuò)大規(guī)模。我們相信,這種技術(shù)是一種有用的酶促合成寡核苷酸方法。另外,同源重組不僅在生物進(jìn)化中起重要的作用,而且成為定向改造基因的技術(shù)。據(jù)報(bào)道,微生物可以吸收外界單鏈DNA,并且在體內(nèi)將外界DNA插入到基因組同源區(qū)域內(nèi),從而造成基因組的定點(diǎn)突變。我們將雙鏈DNA及經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的雙鏈DNA導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)時(shí),預(yù)期遺傳重組的效率可能會(huì)有所提高。為此,我們選取質(zhì)粒pBR322為研究對(duì)象,設(shè)計(jì)了其β-內(nèi)酰胺酶基因移碼突變體。在外源單鏈野生型寡核苷酸的作用下,移碼突變位點(diǎn)可以被定向修復(fù),檢測(cè)到少量恢復(fù)突變體。然而,雙鏈寡核苷酸非但沒(méi)有提高修復(fù)效率,反而沒(méi)有檢測(cè)到恢復(fù)突變體。同時(shí)發(fā)現(xiàn),在沒(méi)有寡核苷酸介導(dǎo)的情況下,移碼突變也可以自發(fā)恢復(fù)。對(duì)回復(fù)突變菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng),觀察到其存活率和生長(zhǎng)速率隨著代數(shù)增加而逐漸增長(zhǎng)的現(xiàn)象,移碼突變后讀碼框恢復(fù)不是快速的而是漸進(jìn)式的。對(duì)自發(fā)恢復(fù)的菌株進(jìn)行了測(cè)序分析,結(jié)果顯示,在抗生素的篩選作用下,在移碼突變位點(diǎn)前后不同位置插入隨機(jī)的堿基,進(jìn)而定向修復(fù)了移碼突變。
【關(guān)鍵詞】：PEAR 修飾性寡核苷酸 同源重組 移碼突變 回復(fù)突變
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q78
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 PEAR技術(shù)制備修飾性反義寡核昔酸12-50
• 1 前言12-23
• 1.1 反義寡核苷酸12-17
• 1.1.1 反義寡核苷酸的定義12
• 1.1.2 反義寡核苷酸的化學(xué)修飾12-17
• 1.1.2.1 磷酸骨架修飾13-14
• 1.1.2.2 堿基修飾14-16
• 1.1.2.3 糖環(huán)修飾16-17
• 1.2 其他類型寡核苷酸17-20
• 1.2.1 siRNA17-18
• 1.2.2 三股螺旋寡核苷酸18-19
• 1.2.3 CpG寡核苷酸19
• 1.2.4 核酸配合體19-20
• 1.3 寡核苷酸擴(kuò)增技術(shù)20
• 1.4 寡核苷酸大規(guī)模制備技術(shù)存在的問(wèn)題20-21
• 1.5 PEAR技術(shù)21-22
• 1.7 核酸質(zhì)譜分析技術(shù)22-23
• 2 研究?jī)?nèi)容和意義23-24
• 3 材料和方法24-28
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料24-25
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法25-28
• 3.2.1 PEAR反應(yīng)25-26
• 3.2.1.1 PEAR反應(yīng)體系25-26
• 3.2.1.2 PEAR反應(yīng)程序26
• 3.2.2 PEAR產(chǎn)物PAGE電泳檢測(cè)26
• 3.2.3 PEAR產(chǎn)物質(zhì)譜檢測(cè)26-28
• 3.2.3.1 PEAR產(chǎn)物純化26
• 3.2.3.2 PEAR產(chǎn)物的完全酶切26-27
• 3.2.3.3 PEAR酶切產(chǎn)物質(zhì)譜分析27-28
• 4 結(jié)果和討論28-47
• 4.1 結(jié)果28-45
• 4.1.1 PEAR擴(kuò)增修飾性寡核苷酸28-36
• 4.1.1.1 PEAR反應(yīng)體系中Phusion DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶及限制性內(nèi)切酶PspGI濃度的優(yōu)化28
• 4.1.1.2 利用Phusion DNA聚合酶,PEAR擴(kuò)增2'-F-dNTPs修飾的寡核苷酸28-31
• 4.1.1.3 PEAR產(chǎn)物作為“種子”進(jìn)行二輪擴(kuò)增31-32
• 4.1.1.4 利用KOD DNA聚合酶擴(kuò)增2'-F-dNTPs修飾寡核苷酸32-34
• 4.1.1.5 利用KOD DNA聚合酶,PEAR擴(kuò)增dTTPαS修飾和2 '-F-dATP/dNTPaSs混合修飾寡核苷酸34-36
• 4.1.2 PEAR產(chǎn)物組分的質(zhì)譜檢測(cè)36-45
• 4.2 PEAR技術(shù)優(yōu)勢(shì)45-46
• 4.3 討論46-47
• 5 結(jié)論47-50
• 第二章 移碼突變恢復(fù)相關(guān)研究50-76
• 1 前言50-57
• 1.2 定點(diǎn)誘變50-54
• 1.2.1 定點(diǎn)誘變的概述50-51
• 1.2.2 定點(diǎn)誘變的方法51-52
• 1.2.3 PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變52-54
• 1.3 遺傳重組54-57
• 1.3.1 同源重組55
• 1.3.2 位點(diǎn)特異性重組55-56
• 1.3.3 轉(zhuǎn)座重組56
• 1.3.4 寡核苷酸介導(dǎo)的遺傳重組56-57
• 1.4 回復(fù)突變57
• 2 研究?jī)?nèi)容和意義57-58
• 3 材料和方法58-65
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料58
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法58-65
• 3.2.1 質(zhì)粒pBR322 β-內(nèi)酰胺酶基因移碼突變的制備58-63
• 3.2.1.1 質(zhì)粒pBR322轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞及質(zhì)粒的提取58-59
• 3.2.1.2 重疊延伸PCR59-61
• 3.2.1.3 PCR產(chǎn)物的雙酶切61
• 3.2.1.4 pBR322的雙酶切61-62
• 3.2.1.5 酶切產(chǎn)物的連接62
• 3.2.1.6 pBR322/Amp轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞62-63
• 3.2.1.7 測(cè)序63
• 3.2.2 寡核苷酸介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶基因功能恢復(fù)63-64
• 3.2.2.1 E.coli JM109/pBR322/Amp~-感受態(tài)細(xì)胞的制備63
• 3.2.2.2 寡核苷酸轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli JM109/pBR322/Amp~-63-64
• 3.2.2.3 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),計(jì)算抗性恢復(fù)率64
• 3.2.2.4 培養(yǎng)純化測(cè)序64
• 3.2.3 抗性自發(fā)恢復(fù)菌株測(cè)序64-65
• 4 結(jié)果與討論65-76
• 4.1 結(jié)果與分析65-73
• 4.1.1 E.coli JM109/pBR322/Amp~-的獲得65-69
• 4.1.1.1 E.coli JM109/pBR322的獲得65-66
• 4.1.1.2 重疊延伸PCR66-67
• 4.1.1.3 質(zhì)粒pBR322/Amp~-的構(gòu)建67-68
• 4.1.1.4 pBR322/Amp~-測(cè)序68-69
• 4.1.2 寡核苷酸介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶活性的恢復(fù)69-71
• 4.1.3 自然條件下β-內(nèi)酰胺酶活性的恢復(fù)71-73
• 4.2 討論73-76
• 4.2.1 寡核苷酸介導(dǎo)的同源重組73-75
• 4.2.2 移碼突變恢復(fù)75-76
• 5 結(jié)論76
• 參考文獻(xiàn)76-85
• 附錄85-96
• 附錄Ⅰ 常用溶液配制85-89
• 附錄Ⅱ 主要實(shí)驗(yàn)儀器89-90
• 附錄Ⅲ 常規(guī)實(shí)驗(yàn)步驟90-93
• 附錄Ⅳ 寡核苷酸序列匯總93-94
• 附錄Ⅴ DNA及蛋白質(zhì)序列94-96
• 致謝96-97
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷97
• 發(fā)表的學(xué)術(shù)論文97

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本文編號(hào)：304755