發(fā)布時(shí)間：2017-04-13 21:38

  本文關(guān)鍵詞：USP15、USP21抑制劑篩選及去泛素化酶活性檢測(cè)系統(tǒng)改進(jìn)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：蛋白質(zhì)的泛素化修飾是一種重要的翻譯后修飾方式,被泛素分子修飾的蛋白在去泛素化酶的作用下可以水解掉所帶的泛素。在過去的5到10年間,許多研究結(jié)果都表明去泛素化酶在體內(nèi)的許多生理過程中起到了重要作用,而去泛素化酶的異常與包括腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、血液疾病、感染在內(nèi)的多種人類疾病相關(guān)。因此,許多科研機(jī)構(gòu)和醫(yī)藥公司都在努力尋找去泛素化酶的抑制劑。泛素特異性水解酶USP15被報(bào)道可以調(diào)節(jié)TGF-p信號(hào)通路,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。還可以通過穩(wěn)定MDM2,負(fù)調(diào)控T細(xì)胞的活性,以及調(diào)節(jié)p53的功能,抑制USP15的活性,可以誘導(dǎo)腫瘤的凋亡,以及促進(jìn)抗腫瘤T細(xì)胞應(yīng)答。因此,USP15被認(rèn)為是一個(gè)非常好的抗腫瘤治療靶點(diǎn)。此外,也有文章指出,抑制USP15的活性,也可以作為治療帕金森的一個(gè)途徑。然而,到目前為止,并沒有發(fā)現(xiàn)一個(gè)特異性針對(duì)USP15的抑制劑,PR-619雖然可以很好的抑制USP15的活性,但PR-619是一個(gè)廣譜的去泛素化酶抑制劑,缺乏特異性導(dǎo)致其應(yīng)用受到了極大的限制。泛素特異性水解酶USP21被報(bào)道可以負(fù)調(diào)控NF-KB信號(hào)通路和RIG-Ⅰ介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素信號(hào)通路,可以去H2A的單泛素化進(jìn)而調(diào)控下游因子的轉(zhuǎn)錄,還可以穩(wěn)定GATA3進(jìn)而上調(diào)FOXP3在Treg細(xì)胞中的水平。此外,我們實(shí)驗(yàn)室也發(fā)現(xiàn)了USP21在固有免疫以及干細(xì)胞干性維持中具有重要作用。然而,與USP15一樣,雖然PR-619可以抑制USP21的去泛素化酶活性,但缺乏特異性,目前特異性針對(duì)USP21的抑制劑也沒有被報(bào)道。在本文中,我們應(yīng)用Ub-Nanoluc去泛素化酶活性檢測(cè)系統(tǒng)分別對(duì)USP15和USP21進(jìn)行了小分子抑制劑的篩選,并在體外水平證明了篩選出的小分子化合物確實(shí)分別可以抑制USP15和USP21的去泛素化酶活性。為了篩選去泛素化酶的抑制劑,研究人員開發(fā)出了多種檢測(cè)去泛素化酶活性的方法。我們實(shí)驗(yàn)室利用一種新型穩(wěn)定靈敏度高的報(bào)告基因Nanoluc開發(fā)出了一套檢測(cè)去泛素化酶活性的方法,但是由于所用固相載體為Ni-NTA beads,操作十分繁雜。為了簡(jiǎn)化操作,提高方法的通量性,在本文的研究中,我們將固相載體換成了鎳包被的96孔白板。改進(jìn)后的方法操作更為簡(jiǎn)便,更適合于高通量的篩選工作。綜上所述,本文篩選了去泛素化酶USP15和USP21的小分子抑制劑,并在體外水平證明了其抑制作用。此外,本文還對(duì)基于Nanoluc報(bào)告基因的去泛素化酶活性檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn),使其操作更為便捷易行,更適合于高通量的篩選工作。
【關(guān)鍵詞】：USP15 USP21 抑制劑 去泛素化酶活性檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q503
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 第一章 研究背景及文獻(xiàn)綜述11-27
• 第一節(jié) 去泛素化酶概述11-21
• 第二節(jié) 去泛素化酶活性檢測(cè)方法概述21-25
• 第三節(jié) 去泛素化酶抑制劑研究進(jìn)展25-27
• 第二章 材料與方法27-51
• 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料27-32
• 第二節(jié) 常用實(shí)驗(yàn)試劑的配制32-40
• 第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法40-51
• 第三章 結(jié)果與分析51-83
• 第一節(jié) 去泛素化酶USP15抑制劑的篩選51-62
• 第二節(jié) 去泛素化酶USP21抑制劑篩選62-69
• 第三節(jié) 通量化去泛素化酶活性檢測(cè)系統(tǒng)的改進(jìn)69-83
• 第四章 總結(jié)與討論83-85
• 附錄Ⅰ USP15抑制劑初篩85-92
• 附錄Ⅱ 化合物對(duì)Nanoluc讀值的影響92-93
• 附錄Ⅲ 縮略詞93-94
• 附錄Ⅳ 科研成果94-95
• 參考文獻(xiàn)95-103
• 致謝103-104

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