作為毛紡產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質(zhì)原材料,絨山羊所產(chǎn)的羊絨纖細柔軟。但如今在絨山羊育種過程中存在為提高羊絨產(chǎn)量盲目雜交,造成羊絨質(zhì)量降低等問題,亟待以現(xiàn)代生物技術(shù)實現(xiàn)品種改良。胸腺素β4（Thymosinbeta4,Tβ4）可以誘導毛囊形成進而調(diào)節(jié)哺乳動物毛發(fā)生長,加速毛囊干細胞的分化、遷移,還可通過促進血管生成達到間接促進毛發(fā)生長的作用。本實驗利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在絨山羊骨骼肌衛(wèi)星細胞上進行Tβ4基因的定點敲入,結(jié)合體細胞核移植技術(shù)獲得Tβ4基因定點敲入的絨山羊,為絨山羊的遺傳育種提供新的方法。1、Tβ4基因定點整合載體的構(gòu)建使用麻省理工學院的CRISPR設計軟件在CCR5的第二外顯子上設計了 6對20bp的靶序列,以gRNA-T2為模板,使用整體PCR的方法,擴增得到大小為455bp的gRNA。利用surveyor突變檢測試劑盒進行效率檢測,最終確定了一對突變效率較高的gRNA,用于下一步實驗。同時構(gòu)建了由上游同源臂、Kap6.1啟動子、Tβ4基因、polyA和下游同源臂5部分組成的Tβ4同源重組載體。2、Tβ4基因定點整合單克隆細胞系的獲得采用電穿孔轉(zhuǎn)染法將Cas9環(huán)狀質(zhì)粒、4... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古大學內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 CRISPR/Cas9系統(tǒng)概述
    1 CRISPR-Cas9的研究進程
    2 CRISPR-Cas9的基因座結(jié)構(gòu)
    3 CRISPR-Cas9的作用原理
    4 CRISPR-Cas9在動物基因編輯上的應用
    5 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的優(yōu)勢與局限
    6 結(jié)語
第二章 CRISPR/Cas9介導絨山羊Tβ4基因定點敲入的研究
    1 引言
        1.1 Tβ4基因定點整合載體的構(gòu)建
        1.2 Tβ4基因定點整合單克隆細胞系的獲得
        1.3 Tβ4基因定點整合絨山羊的制備
    2 材料和方法
        2.1 材料
            2.1.1 主要儀器設備
            2.1.2 試劑與耗材
            2.1.3 實驗材料
        2.2 方法
            2.2.1 Tβ4基因定點整合載體的構(gòu)建
            2.2.2 Tβ4基因定點整合單克隆細胞系的獲得
            2.2.3 Tβ4基因定點整合絨山羊的制備
    3 結(jié)果
        3.1 Tβ4基因定點整合載體的構(gòu)建
            3.1.1 gRNA表達載體的構(gòu)建
            3.1.2 SURVEYOR酶切效率檢測
            3.1.3 Tβ4基因的獲得
            3.1.4 上下游同源臂的獲得
            3.1.5 Tβ4同源重組載體的構(gòu)建
        3.2 Tβ4基因定點整合單克隆細胞系的獲得
            3.2.1 單克隆細胞系的獲得
            3.2.2 Tβ4基因隨機整合細胞系的鑒定
            3.2.3 Tβ4基因定點整合細胞系的鑒定
        3.3 Tβ4基因定點整合絨山羊的制備
            3.3.1 卵母細胞的采集與體外成熟
            3.3.2 重構(gòu)胚的構(gòu)建及融合
            3.3.3 重構(gòu)胚的體外培養(yǎng)及移植
            3.3.4 轉(zhuǎn)基因絨山羊的接產(chǎn)及鑒定
    4 討論
        4.1 Tβ4 基因定點整合載體的構(gòu)建
        4.2 Tβ4基因定點整合單克隆細胞系的獲得
        4.3 Tβ4基因定點整合絨山羊的制備
結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]CRISPR-Cas9研究進展及在基因治療上的應用[J]. 劉瑞琪,王瑋瑋,吳勇延,趙秋云,王勇勝,卿素珠.  中國生物工程雜志. 2016(10)
[2]豬體細胞核移植技術(shù)研究進展[J]. 張宏燕,信吉閣.  生物技術(shù)通報. 2016(08)
[3]CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)研究進展及其在動物基因編輯研究中的應用[J]. 王瑋瑋,劉瑞琪,吳勇延,楊嚴格,王勇勝,卿素珠.  畜牧獸醫(yī)學報. 2016(07)
[4]CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究進展及其在畜禽遺傳改良中的應用前景[J]. 堵晶晶,李強,程霄,沈林園,李學偉,張順華,朱礪.  中國生物工程雜志. 2016(07)
[5]CRISPR/Cas9介導的基因組編輯技術(shù)[J]. 寧靜,李明煜,魯鳳民.  生物學通報. 2016(04)
[6]體細胞核移植技術(shù)的研究進展[J]. 張鵬.  中國醫(yī)藥科學. 2016(05)
[7]CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)在農(nóng)業(yè)動物中的應用[J]. 幸宇云,楊強,任軍.  遺傳. 2016(03)
[8]體細胞克隆牛生產(chǎn)效率的影響因素[J]. 王愛兵,張勝,王金柱,李武,唐博,張學明,李子義.  吉林農(nóng)業(yè)大學學報. 2015(02)
[9]豬體細胞核移植的影響因素[J]. 陳思,羅光彬,王輝田,孫超.  豬業(yè)科學. 2014(02)
[10]體細胞核移植技術(shù)在豬基因修飾中的應用[J]. 朱向星,全守能,黃勇,盧晟盛.  基因組學與應用生物學. 2013(06)

博士論文
[1]源于嗜熱鏈球菌的真核CRISPR/Cas9系統(tǒng)的建立、優(yōu)化及其應用研究[D]. 徐坤.西北農(nóng)林科技大學 2015
[2]阿爾巴斯白絨山羊不同種類成體干細胞對轉(zhuǎn)基因克隆效率影響的研究[D]. 任宇.內(nèi)蒙古大學 2014
[3]利用體細胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因絨山羊的研究[D]. 袁建龍.內(nèi)蒙古大學 2013

碩士論文
[1]CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導羊MSTN基因敲除和定點整合fat-1基因的研究[D]. 張駒.內(nèi)蒙古大學 2016
[2]CRISPR-Cas9技術(shù)介導阿爾巴斯白絨山羊MSTN基因敲除的研究[D]. 劉健.內(nèi)蒙古大學 2015
[3]CRISPR-Cas9介導FGF5敲除及Noggin過表達對毛發(fā)生長相關因子影響[D]. 張蒙.內(nèi)蒙古大學 2015
[4]CRISPR/Cas9技術(shù)對綿羊肌肉衛(wèi)星細胞MSTN基因的靶向敲除研究[D]. 李聰.中國農(nóng)業(yè)科學院 2015
[5]Tβ4轉(zhuǎn)基因絨山羊中目的基因拷貝數(shù)及表達量與產(chǎn)絨性能關系的研究[D]. 郭棟東.內(nèi)蒙古大學 2014



本文編號：3021072