作為毛紡產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質(zhì)原材料,絨山羊所產(chǎn)的羊絨纖細(xì)柔軟。但如今在絨山羊育種過(guò)程中存在為提高羊絨產(chǎn)量盲目雜交,造成羊絨質(zhì)量降低等問(wèn)題,亟待以現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)現(xiàn)品種改良。胸腺素β4（Thymosinbeta4,Tβ4）可以誘導(dǎo)毛囊形成進(jìn)而調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物毛發(fā)生長(zhǎng),加速毛囊干細(xì)胞的分化、遷移,還可通過(guò)促進(jìn)血管生成達(dá)到間接促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的作用。本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在絨山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞上進(jìn)行Tβ4基因的定點(diǎn)敲入,結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得Tβ4基因定點(diǎn)敲入的絨山羊,為絨山羊的遺傳育種提供新的方法。1、Tβ4基因定點(diǎn)整合載體的構(gòu)建使用麻省理工學(xué)院的CRISPR設(shè)計(jì)軟件在CCR5的第二外顯子上設(shè)計(jì)了 6對(duì)20bp的靶序列,以gRNA-T2為模板,使用整體PCR的方法,擴(kuò)增得到大小為455bp的gRNA。利用surveyor突變檢測(cè)試劑盒進(jìn)行效率檢測(cè),最終確定了一對(duì)突變效率較高的gRNA,用于下一步實(shí)驗(yàn)。同時(shí)構(gòu)建了由上游同源臂、Kap6.1啟動(dòng)子、Tβ4基因、polyA和下游同源臂5部分組成的Tβ4同源重組載體。2、Tβ4基因定點(diǎn)整合單克隆細(xì)胞系的獲得采用電穿孔轉(zhuǎn)染法將Cas9環(huán)狀質(zhì)粒、4... 

【文章來(lái)源】：內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：62 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 CRISPR/Cas9系統(tǒng)概述
    1 CRISPR-Cas9的研究進(jìn)程
    2 CRISPR-Cas9的基因座結(jié)構(gòu)
    3 CRISPR-Cas9的作用原理
    4 CRISPR-Cas9在動(dòng)物基因編輯上的應(yīng)用
    5 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)與局限
    6 結(jié)語(yǔ)
第二章 CRISPR/Cas9介導(dǎo)絨山羊Tβ4基因定點(diǎn)敲入的研究
    1 引言
        1.1 Tβ4基因定點(diǎn)整合載體的構(gòu)建
        1.2 Tβ4基因定點(diǎn)整合單克隆細(xì)胞系的獲得
        1.3 Tβ4基因定點(diǎn)整合絨山羊的制備
    2 材料和方法
        2.1 材料
            2.1.1 主要儀器設(shè)備
            2.1.2 試劑與耗材
            2.1.3 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2 方法
            2.2.1 Tβ4基因定點(diǎn)整合載體的構(gòu)建
            2.2.2 Tβ4基因定點(diǎn)整合單克隆細(xì)胞系的獲得
            2.2.3 Tβ4基因定點(diǎn)整合絨山羊的制備
    3 結(jié)果
        3.1 Tβ4基因定點(diǎn)整合載體的構(gòu)建
            3.1.1 gRNA表達(dá)載體的構(gòu)建
            3.1.2 SURVEYOR酶切效率檢測(cè)
            3.1.3 Tβ4基因的獲得
            3.1.4 上下游同源臂的獲得
            3.1.5 Tβ4同源重組載體的構(gòu)建
        3.2 Tβ4基因定點(diǎn)整合單克隆細(xì)胞系的獲得
            3.2.1 單克隆細(xì)胞系的獲得
            3.2.2 Tβ4基因隨機(jī)整合細(xì)胞系的鑒定
            3.2.3 Tβ4基因定點(diǎn)整合細(xì)胞系的鑒定
        3.3 Tβ4基因定點(diǎn)整合絨山羊的制備
            3.3.1 卵母細(xì)胞的采集與體外成熟
            3.3.2 重構(gòu)胚的構(gòu)建及融合
            3.3.3 重構(gòu)胚的體外培養(yǎng)及移植
            3.3.4 轉(zhuǎn)基因絨山羊的接產(chǎn)及鑒定
    4 討論
        4.1 Tβ4 基因定點(diǎn)整合載體的構(gòu)建
        4.2 Tβ4基因定點(diǎn)整合單克隆細(xì)胞系的獲得
        4.3 Tβ4基因定點(diǎn)整合絨山羊的制備
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR-Cas9研究進(jìn)展及在基因治療上的應(yīng)用[J]. 劉瑞琪,王瑋瑋,吳勇延,趙秋云,王勇勝,卿素珠.  中國(guó)生物工程雜志. 2016(10)
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[3]CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)研究進(jìn)展及其在動(dòng)物基因編輯研究中的應(yīng)用[J]. 王瑋瑋,劉瑞琪,吳勇延,楊嚴(yán)格,王勇勝,卿素珠.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2016(07)
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博士論文
[1]源于嗜熱鏈球菌的真核CRISPR/Cas9系統(tǒng)的建立、優(yōu)化及其應(yīng)用研究[D]. 徐坤.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2015
[2]阿爾巴斯白絨山羊不同種類成體干細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)基因克隆效率影響的研究[D]. 任宇.內(nèi)蒙古大學(xué) 2014
[3]利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因絨山羊的研究[D]. 袁建龍.內(nèi)蒙古大學(xué) 2013

碩士論文
[1]CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)羊MSTN基因敲除和定點(diǎn)整合fat-1基因的研究[D]. 張駒.內(nèi)蒙古大學(xué) 2016
[2]CRISPR-Cas9技術(shù)介導(dǎo)阿爾巴斯白絨山羊MSTN基因敲除的研究[D]. 劉健.內(nèi)蒙古大學(xué) 2015
[3]CRISPR-Cas9介導(dǎo)FGF5敲除及Noggin過(guò)表達(dá)對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)相關(guān)因子影響[D]. 張蒙.內(nèi)蒙古大學(xué) 2015
[4]CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)綿羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞MSTN基因的靶向敲除研究[D]. 李聰.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2015
[5]Tβ4轉(zhuǎn)基因絨山羊中目的基因拷貝數(shù)及表達(dá)量與產(chǎn)絨性能關(guān)系的研究[D]. 郭棟東.內(nèi)蒙古大學(xué) 2014



本文編號(hào)：3021072