豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是當(dāng)前臨床上導(dǎo)致仔豬腹瀉最常見的致病性病原之一,自1971年該病被發(fā)現(xiàn)起,時(shí)至今日仍持續(xù)危害著整個(gè)養(yǎng)豬業(yè),給我國造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究為了掌握目前山東多個(gè)地區(qū)PEDV流行毒株S基因的遺傳變異情況,并對PEDV疫苗株、變異株與經(jīng)典株建立鑒別診斷方法,利用建立的鑒別診斷方法對臨床上大批量樣品進(jìn)行檢測鑒定。試驗(yàn)采用Trizol法提取病毒總RNA,針對PEDV S基因設(shè)計(jì)4對特異性引物,RT-PCR方法分段擴(kuò)增S基因全序列,將本研究所獲得的PEDV毒株序列與其他地區(qū)分離得到的流行株基因序列對比、分析,構(gòu)建PEDV S基因遺傳進(jìn)化樹;針對ORF3基因缺失部位與S基因的變異區(qū)域設(shè)計(jì)兩對特異性引物利用雙重RT-PCR技術(shù)建立鑒別診斷PEDV三種毒株的方法。試驗(yàn)結(jié)果顯示,PEDV疑似病料的總陽性率為76.40%,同源性分析本研究獲得的8株P(guān)EDV變異株,此8株變異株的S基因序列多處存在插入、缺失與變異現(xiàn)象,且各毒株的基因序列之間存在較大的差異,從遺傳進(jìn)化樹上可觀察到此8株變異株分別位于三個(gè)大分支上;本研究... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

PEDV基因組結(jié)構(gòu)示意圖；(b)PEDV結(jié)構(gòu)示意圖（Songetal.,2012）

不同毒株與兩種引物所擴(kuò)增的基因片段的大小差異，對三者進(jìn)行鑒別。表4PEDV變異株、經(jīng)典株、疫苗株鑒別引物序列及大小Table4SequenceandsizeofprimersforidentifyingPEDVvariants,classicalstrainsandvaccinestrains名稱name引物序列Primersequence條帶大小Stripsize擴(kuò)增毒株Amplifiedstrain擴(kuò)增基因AmplifiedgeneGF：GTTGGCAGCGCGTTTTGCTGTCR：GCTGCTTTACCATTGAGAAAAG198bp變異株、經(jīng)典株ORF3149bp疫苗株CF：ACAAGATGTCACTAGGTGCCAGR：ATGCCGACAACAATATCTTTTC429bp經(jīng)典株疫苗株S圖2G、C兩種引物分別在ORF3基因與S基因上的擴(kuò)增示意圖（圖片來源：引自www.ncbi.nlm.nih.gov）Fig.2SchematicdiagramoftheamplificationofGandCprimersontheORF3geneandSgenerespectively(photosource:www.ncbi.nlm.nih.gov)a：G引物在疫苗株上的擴(kuò)增示意圖；b：G引物在經(jīng)典株/變異株上的擴(kuò)增示意圖；c：C引物在經(jīng)典株/疫苗株上的擴(kuò)增示意圖；a:SchematicdiagramofamplificationofGprimersonvaccinestrains;b:SchematicdiagramofamplificationofGprimersonclassicstrains/mutantstrains;c:SchematicdiagramofamplificationofGprimersonclassicstrains/vaccinestrains;

PEDV變異株的分子流行病學(xué)調(diào)查及三種毒株雙重RT-PCR鑒別檢測方法的建立223結(jié)果與分析3.1PEDV陽性檢測結(jié)果與分析以Trizol法提取出的豬糞便RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以得到的cDNA作為PCR模板，應(yīng)用P引物進(jìn)行基因擴(kuò)增，對全部樣品進(jìn)行陽性檢測。根據(jù)預(yù)期設(shè)計(jì)，其擴(kuò)增產(chǎn)物大小為273bp，經(jīng)電泳結(jié)果觀察對比，實(shí)際結(jié)果與預(yù)期一致（圖3）。本試驗(yàn)樣品分別采集于山東省的9個(gè)地區(qū)多個(gè)PEDV疑似發(fā)病豬場，樣品采集總數(shù)為1212份，共檢出PEDV陽性樣品為926份，總陽性檢出率為76.40%（表5）。帶毒豬與發(fā)病豬可通過糞便向外界排毒，繼而在豬群內(nèi)造成持續(xù)感染的現(xiàn)象，因此在有發(fā)病豬與帶毒豬的豬群內(nèi)PEDV的陽性檢出率極高。圖3豬流行性腹瀉病毒陽性檢測結(jié)果Fig.3PositiveresultsofporcineepidemicdiarrheavirusM：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2501）；1-2：豬流行性腹瀉病毒病料M:DNAMarker(DL2501);1-2:PorcineEpidemicDiarrheaVirus表5PEDV樣品陽性率統(tǒng)計(jì)Table5PEDVsamplepositiveratestatistics采樣地區(qū)Samplingarea采集時(shí)間Acquisitiontime采集樣品數(shù)Numberofsamplescollected陽性樣品數(shù)Numberofpositivesamples陽性率（%）Positiverate(%)濟(jì)南2019.51289876.56

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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