豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的急性腸道傳染病。對(duì)豬尤其是仔豬的危害極為嚴(yán)重,可導(dǎo)致仔豬腹瀉,脫水甚至死亡。自2010年以來(lái),以PEDV變異株引起的高發(fā)病率和高死亡率為特征的PED在世界范圍內(nèi)大面積流行,導(dǎo)致大量仔豬患病死亡,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。盡管近年來(lái)在闡明PED的分子流行病學(xué),診斷,預(yù)防和治療方面取得了進(jìn)展,但其流行爆發(fā)仍在繼續(xù)增加,給養(yǎng)豬業(yè)和國(guó)際貿(mào)易帶來(lái)了嚴(yán)峻的問(wèn)題。馬齒莧（Portulaca oleracea L.,PO）為石竹目馬齒莧科馬齒莧屬的一年生草本植物。廣泛的分布于世界各地的熱帶和亞熱帶地區(qū),屬于藥食兩用中藥,具有清熱解毒、涼血止血、止瀉止痢的功效�，F(xiàn)代藥理研究表明馬齒莧具有消炎、抗菌抗病毒、抗氧化、降血糖血脂、增強(qiáng)免疫力等多種作用。為了探究馬齒莧對(duì)豬流行性腹瀉病毒的抑制作用以及作用機(jī)制,本研究首先制備了馬齒莧提取物,評(píng)估了馬齒莧提取物對(duì)VH細(xì)胞和Vero細(xì)胞的藥物安全范圍,然后用PEDV感染VH細(xì)胞和Vero細(xì)胞,... 

【文章來(lái)源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：59 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

PEDV基因組結(jié)構(gòu)(Leeetal.，2015)

馬齒莧提取物體外抑制豬流行性腹瀉病毒復(fù)制的作用分析20圖2給藥方式示意Figure2.ExperimentalprotocolstoidentifytheinhibitoryeffectsofPOonPEDVinfection.2.2.1.7免疫熒光檢測(cè)病毒蛋白的表達(dá)2.2.1.7.1溶液配制1)PBT1(pH=7.2)：稱(chēng)取1gBSA粉末，加入TritonX-100100μL，驢血清5mL，用1×PBS定容至100mL，漩渦振蕩至完全溶解，用0.22μm濾器過(guò)濾并分裝，-20℃保存。2)PBT2(pH=7.2)：稱(chēng)取1gBSA粉末，加入TritonX-100100μL，用1×PBS定容至100mL，漩渦振蕩至完全溶解，用0.22μm濾器過(guò)濾并分裝，-20℃保存。3)封片劑：甘油與1×PBS以1:1比例混合，室溫保存。2.2.1.7.2間接免疫熒光將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VH細(xì)胞(4×105個(gè)/mL)消化吹打，轉(zhuǎn)移到預(yù)先放置了細(xì)胞爬片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)孔設(shè)為Negative、Positive、6.25、12.5和25五個(gè)組，接毒前換成分別含有0、0、6.25、12.5和25mg/mLPO的培養(yǎng)基作用6h，接毒后再換成相同的培養(yǎng)基作用48h(Negative組不接毒)。間接免疫熒光操作如下：1)爬片預(yù)處理：將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基棄除，1×PBS清洗三次，每次3min；2)細(xì)胞固定：向處理好的爬片上滴加200μL4%的甲醛溶液，固定10min；3)細(xì)胞通透：將固定過(guò)的細(xì)胞爬片，用1×PBS洗三遍，每遍3min，加入200μL含0.2%的TritionX-100的1×PBS，室溫通透8min；

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文253結(jié)果與分析3.1病毒滴度水平的變化PEDVJX16毒株是由山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在山東莒縣某規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)的病豬體內(nèi)分離到的變異毒株，該病毒成功分離后在Vero細(xì)胞上擴(kuò)增了40代，更換為VH細(xì)胞繼續(xù)傳代，贈(zèng)與我實(shí)驗(yàn)室的為第54代，病毒滴度為106.5TCID50/mL。將病毒在VH細(xì)胞上連續(xù)傳至80代，每5代測(cè)定TCID50，病毒滴度隨代次增加而升高，至80代時(shí)達(dá)到107.5TCID50/mL（圖3）。圖3不同代次JX16毒株病毒滴度的變化Figure3.ChangesinvriustitersofJX16strainsindifferentgenerations3.2不同濃度馬齒莧覓水提物對(duì)細(xì)胞活性的影響在針對(duì)PEDV進(jìn)行抗病毒篩選之前，確定所有樣品對(duì)VH細(xì)胞和Vero細(xì)胞活性的影響，以此來(lái)確定藥物的安全范圍。在不同濃度（0、6.25、12.5、25、50和100mg/mL）馬齒莧提取物PO、PO-P和PO-P孵育48h后，用CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞活力。如圖4A所示，用≤25mg/mL的PO處理對(duì)VH細(xì)胞活力沒(méi)有顯著影響（P＞0.05），而高濃度的PO（＞25mg/mL）則明顯降低了細(xì)胞活性。高于25mg/mL的PO-S和PO-P濃度會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定的損害。在Vero細(xì)胞上，PO提取物的安全濃度為≤12.5mg/mL（4B）。根據(jù)結(jié)果，選擇在VH細(xì)胞上不超過(guò)25mg/mL和在Vero細(xì)胞上12.5mg/mL的馬齒莧提取物濃度，作為進(jìn)一步探究藥物對(duì)PEDV復(fù)制

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]馬齒莧“成分-活性-中藥功效-疾病”研究進(jìn)展及關(guān)聯(lián)分析[J]. 秦月雯,侯金麗,王萍,王嵐,殷小杰,張毅,俞勵(lì)平,許海玉.  中草藥. 2020(07)
[2]馬齒莧調(diào)節(jié)人肝癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移裸鼠的血液代謝組學(xué)分析[J]. 林玩福,張夏炎,呂狄亞,趙沙沙,曹靜文,郁沙莎,程彬彬,翟笑楓,鄭國(guó)銀.  中醫(yī)腫瘤學(xué)雜志. 2020(01)
[3]馬齒莧多糖理化性質(zhì)及其抗氧化活性研究[J]. 葉丹蕾,韓苗苗,吳玉蘭,陶晗,汪惠麗.  合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2019(10)
[4]馬齒莧總黃酮對(duì)H2O2致PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用[J]. 蔡帆,張彥,臧林泉.  中藥藥理與臨床. 2019(03)
[5]馬齒莧結(jié)合態(tài)多酚和自由態(tài)多酚抑制肝癌細(xì)胞HepG-2增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究[J]. 王浩毓,趙惠玲,李宏全.  山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2019(04)
[6]不同治療方案對(duì)豬自然感染豬流行性腹瀉的療效觀察[J]. 王艷豐,張丁華,朱金鳳,趙秀敏.  豬業(yè)科學(xué). 2018(12)
[7]馬齒莧多糖對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸組織IL-6/STAT3及NF-κB的影響[J]. 范文濤,王攀紅,王倩.  中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志. 2018(03)
[8]馬齒莧醇提取物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞及其干細(xì)胞體外增殖作用的機(jī)理研究[J]. 熊祎虹,鄧超,白文,劉宇,姚小芹,金黑鷹.  北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào). 2018(01)
[9]馬齒莧多糖體外免疫調(diào)節(jié)活性研究[J]. 陶貴斌,何慧楠,李雪惠,劉雪瑩,齊濱,劉莉.  食品研究與開(kāi)發(fā). 2017(17)
[10]馬齒莧多糖對(duì)環(huán)磷酰胺模型小鼠免疫功能的影響[J]. 孟祥樂(lè),薛磊,張振巍,桂新景,陳玉歡,唐進(jìn)法,李偉霞,曹英杰,趙婭,李學(xué)林.  中國(guó)新藥雜志. 2017(11)

博士論文
[1]豬流行性腹瀉病毒感染豬小腸上皮細(xì)胞抑制IFN-β產(chǎn)生及激活NF-κB機(jī)理研究[D]. 曹麗艷.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015

碩士論文
[1]馬齒莧酰胺E和馬齒莧提取物的神經(jīng)保護(hù)和抗炎活性研究[D]. 李玲玉.山東大學(xué) 2018
[2]馬齒莧多糖的提取分離及其抗?jié)冃越Y(jié)腸炎作用機(jī)理研究[D]. 汪荔.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 2017



本文編號(hào)：2991530