馬鈴薯直鏈淀粉廣泛用于醫(yī)藥、食品等工業(yè)領(lǐng)域,也是生產(chǎn)抗性淀粉的重要原料�，F(xiàn)有馬鈴薯品種直鏈淀粉含量僅為總淀粉含量的25%左右,且直鏈淀粉分離工序損耗大得率低。因此,創(chuàng)造培育高直鏈淀粉含量的馬鈴薯品種對于促進我國馬鈴薯淀粉加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。CRISPR-Cas9技術(shù)能夠利用單鏈RNA引導(dǎo)Cas9蛋白酶對基因組進行定點編輯,是近年來新興的基因編輯技術(shù),具有高效便捷、多位點同時編輯以及可剔除篩選標(biāo)記等優(yōu)勢。SBE基因編碼馬鈴薯支鏈淀粉合成途徑的關(guān)鍵酶,具有SBEⅠ和SBEⅡ兩個亞型。本研究利用CRISPR技術(shù)敲除兩個SBE基因,以期獲得高直鏈淀粉含量的馬鈴薯新品種。試驗以SBEⅠ和SBEⅡ蛋白功能結(jié)構(gòu)域第9個外顯子20bp序列為靶標(biāo),AtU3b和AtU6-1分別啟動兩個sgRNA,CaMV35S為Cas9蛋白啟動子,構(gòu)建pYLCRISPR/Cas9-MTdi-SBEI-ⅡgRNA載體。通過農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化獲得44個馬鈴薯轉(zhuǎn)化株,PCR、測序鑒定獲得36個陽性轉(zhuǎn)化株。靶序列測序結(jié)果表明,有5株在SBEⅠ靶位點上出現(xiàn)突變,1株在SBEⅡ靶位點上出現(xiàn)突變,共出現(xiàn)10種突變類型,包括1bp的插... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞
一. 前言
    1.1 馬鈴薯
    1.2 馬鈴薯直鏈淀粉及淀粉分支酶
        1.2.2 馬鈴薯直鏈淀粉特性及應(yīng)用
        1.2.3 淀粉合成途徑及相關(guān)酶
        1.2.4 淀粉分支酶基因（SBE）
    1.3 CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)
        1.3.1 CRISPR技術(shù)基本原理及優(yōu)勢
        1.3.2 CRISPR技術(shù)在動植物中的應(yīng)用
        1.3.3 CRISPR編輯效率的影響因素
    1.4 研究目的和意義
二. 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株
        2.1.3 載體
        2.1.4 試劑與儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 設(shè)計基因靶序列
        2.2.2 CRISPR載體構(gòu)建
        2.2.3 三親融合法
        2.2.4 馬鈴薯試管苗的培養(yǎng)
        2.2.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯莖段轉(zhuǎn)化
        2.2.6 植物基因組DNA的提取
        2.2.7 陽性株鑒定
        2.2.8 測序檢測陽性株打靶效果
        2.2.9 盆苗種植及薯塊收獲
        2.2.10 直鏈淀粉含量測定
三. 實驗結(jié)果
    3.1 載體構(gòu)建
        3.1.1 SBEⅠ和SBEⅡ靶序列選擇及合成
        3.1.2 載體構(gòu)建及陽性篩選
    3.2 馬鈴薯轉(zhuǎn)化株的獲得及鑒定
        3.2.1 轉(zhuǎn)化株的獲得
        3.2.2 轉(zhuǎn)化株打靶檢測
    3.3 收獲及測產(chǎn)
    3.4 直鏈淀粉含量測定
    3.5 載體優(yōu)化
四. 討論
參考文獻(xiàn)
附表1 引物序列
附錄2 培養(yǎng)基、試劑配方及貯存
附錄3 實驗方法與操作
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]2000～2009年世界馬鈴薯生產(chǎn)狀況分析[J]. 吳秋云,黃科,宋勇,何長征,劉明月,熊興耀.  中國馬鈴薯. 2012(02)
[2]直鏈淀粉和支鏈淀粉的表征[J]. 李海普,李彬,歐陽明,張莎莎.  食品科學(xué). 2010(11)
[3]馬鈴薯淀粉的研究及在工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 馬曉東,鐘浩.  農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊). 2008(02)
[4]用RNA干擾技術(shù)創(chuàng)造高直鏈淀粉馬鈴薯材料[J]. 郭志鴻,張金文,王蒂,陳正華.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2008(02)
[5]高直鏈淀粉性質(zhì)及應(yīng)用研究[J]. 王中榮,劉雄.  糧食與油脂. 2005(11)
[6]馬鈴薯淀粉特性及其利用研究[J]. 于天峰,夏平.  中國農(nóng)學(xué)通報. 2005(01)

碩士論文
[1]基于RNAi技術(shù)獲得高含量支鏈淀粉且抗低溫糖化的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品種[D]. 劉永強.內(nèi)蒙古大學(xué) 2014



本文編號：2975522