CRISPR/Cas9是發(fā)現(xiàn)于古細(xì)菌和細(xì)菌中的一種獲得性免疫防御機(jī)制,通過攝取入侵的外源DNA短片段最終形成宿主的間隔序列,從而介導(dǎo)對(duì)病毒和質(zhì)粒的獲得性抗性。由于該系統(tǒng)相對(duì)于以前的基因編輯方法更簡(jiǎn)單易行、可靠高效、靶標(biāo)精準(zhǔn)而被廣泛應(yīng)用到多種生物的基因編輯中,成為一個(gè)準(zhǔn)確打靶的基因編輯工具。本研究以本氏煙草為材料,利用CRISPR/Cas9技術(shù)實(shí)現(xiàn)本氏煙草內(nèi)源PDS（Phytoenedesaturase,八氫番茄紅素脫氫酶）基因和外源GFP（Green Fluorescent Protein,綠色熒光蛋白）基因的編輯工作,建立了本氏煙草CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)和穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系,進(jìn)而探討了 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因組編輯中的應(yīng)用,為將來(lái)開展其它內(nèi)源基因的生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。本論文針對(duì)本氏煙草內(nèi)源基因PDS和外源基因GFP分別預(yù)測(cè)了 3個(gè)和4個(gè)靶標(biāo)位點(diǎn),并設(shè)計(jì)合成了相應(yīng)的guide序列和構(gòu)建了雙元表達(dá)重組載體。其中,將中間克隆載體psgR-Cas9-At質(zhì)粒成功地改造成了操作性強(qiáng)的In-Fusion克隆載體psgR-Cas9-IF-At。將成功構(gòu)建... 

【文章來(lái)源】：內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：83 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 引言
    1.1 CRISPR/CAs9和PTG技術(shù)
        1.1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)展及分類
        1.1.2 CRISPR/Cas的組成和結(jié)構(gòu)
        1.1.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機(jī)制
        1.1.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用
        1.1.5 CRISPR/Cas9的多位點(diǎn)編輯技術(shù)
        1.1.6 CRISPR/Cas9與ZFNs和TALENs的比較
    1.2 植物組織培養(yǎng)及穩(wěn)定轉(zhuǎn)化
        1.2.1 植物組織培養(yǎng)的發(fā)展歷程
        1.2.2 植物組織遺傳轉(zhuǎn)化
        1.2.3 植物瞬時(shí)表達(dá)
        1.2.4 模式植物本氏煙草
第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 克隆載體
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 靶位點(diǎn)的預(yù)測(cè),guide序列的設(shè)計(jì)及克隆
        2.2.2 重組子的雙元表達(dá)載體亞克隆
        2.2.3 利用In-Fusion克隆技術(shù)構(gòu)建編輯載體
        2.2.4 PDS基因多個(gè)位點(diǎn)編輯的載體克隆
        2.2.5 pGREB32重組載體的構(gòu)建
        2.2.6 感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)真空注射法侵染本氏煙草葉片
        2.2.8 CTAB法提取煙葉片草基因組DNA
        2.2.9 基因組RE-PCR
        2.2.10 基因組PCR-RE
        2.2.11 本氏煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中多位點(diǎn)編輯效果的檢測(cè)
        2.2.12 本氏煙草葉圓盤轉(zhuǎn)化
第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
    3.1 PDS靶位點(diǎn)GUIDE序列的克隆
        3.1.1 PDS基因的靶標(biāo)位點(diǎn)guide序列的克隆
        3.1.2 GFP基因的靶標(biāo)位點(diǎn)guide序列的克隆
    3.2 PCAMBIA-GUIDE雙元表達(dá)重組載體的構(gòu)建
    3.3 本氏煙草瞬時(shí)表達(dá)編輯效果的鑒定
        3.3.1 PDS基因組DNA-RE PCR鑒定
        3.3.2 基因組DNA PCR-RE鑒定
    3.4 PTG技術(shù)多位點(diǎn)克隆
    3.5 PDS基因多位點(diǎn)編輯效果的檢測(cè)
    3.6 本氏煙草再生體系的建立及穩(wěn)定遺傳株系的獲得
        3.6.1 本氏煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立
第四章 討論
    4.1 瞬時(shí)表達(dá)的CRISPR/CAS9系統(tǒng)的編輯效果分析
    4.2 CRISPR/CAs9系統(tǒng)在本氏煙草穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化的探究
參考文獻(xiàn)
附錄1
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間取得的成果


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR-Cas9技術(shù)發(fā)展史:25年的科學(xué)歷程[J]. 郭曉強(qiáng).  自然雜志. 2016(04)
[2]抗逆基因GmUBC2的大豆胚尖遺傳轉(zhuǎn)化以及抗性材料的鑒定[J]. 張潔,趙甜甜,鄭文永,商蕾,王月影,邱麗娟,王冬梅.  河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2016(02)
[3]CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因組定點(diǎn)編輯中的研究進(jìn)展[J]. 解莉楠,宋鳳艷,張旸.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2015(09)
[4]農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)影響因素研究[J]. 孫蔓莉,孟玉玲,張強(qiáng),黃桂艷,單衛(wèi)星.  西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2015(01)
[5]CRISPR/Cas系統(tǒng):RNA靶向的基因組定向編輯新技術(shù)[J]. 李君,張毅,陳坤玲,單奇?zhèn)?王延鵬,梁振,高彩霞.  遺傳. 2013(11)
[6]CRISPR/Cas9新型基因打靶系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]. 李輝,施振旦.  江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2013(04)
[7]CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)[J]. 方銳,暢飛,孫照霖,李寧,孟慶勇.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2013(08)
[8]植物細(xì)胞的全能性及應(yīng)用[J]. 孫忠青.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2013(21)
[9]TALEN or Cas9-Rapid,Efficient and Specific Choices for Genome Modifications[J]. Chuanxian Wei,Jiyong Liu,Zhongsheng Yu,Bo Zhang,Guanjun Gao,Renjie Jiao.  Journal of Genetics and Genomics. 2013(06)
[10]植物瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)的主要方法與應(yīng)用進(jìn)展[J]. 趙文婷,魏建和,劉曉東,高志暉.  生物技術(shù)通訊. 2013(02)



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