目的:探討煙酰胺單核苷酸（NMN）抵抗D-半乳糖誘導(dǎo)的HT22細胞衰老的作用效果及分子機制。方法:首先,用不同濃度梯度（10 mM、50 mM、100 mM）的D-半乳糖對HT22細胞進行衰老造模。為確定衰老細胞的最佳時間和濃度,由MTT法檢測細胞的活性,繪制出細胞生長曲線,由β-半乳糖苷酶染色法（Senescence Associated acidic-β-Galactosidase,SA-β-Gal）檢測細胞衰老程度;通過蛋白免疫印跡法（Western Blot,WB）檢測細胞衰老相關(guān)蛋白表達和實時熒光定量PCR法（RT-PCR）檢測細胞衰老相關(guān)基因表達以評價HT22細胞衰老程度。然后,用200μM的NMN給藥的方式對衰老HT22細胞模型進行挽救,同樣通過MTT、SA-β-Gal、WB和RT-PCR評價挽救效果。接著,初步探究NMN抵抗D-半乳糖誘導(dǎo)的HT22細胞衰老的具體機制,檢測NAD⁺的基因表達、總抗氧化能力、SOD酶活性和線粒體膜電位以及沉默信息調(diào)節(jié)因子3（Silent mating type information regulator3,SIRT3）... 

【文章來源】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院)廣東省

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【學(xué)位級別】：碩士

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050年預(yù)測全世界中80歲以上人口的比例分布

第1章引言3和功能層面上都發(fā)生了復(fù)雜變化，如部分酶活力降低、細胞通透性功能退化等。正常細胞在培養(yǎng)中的數(shù)量翻倍取決于物種，不取決于用于建立培養(yǎng)的細胞類型，這與動物的壽命呈正相關(guān)(Childsetal.,2015)。而大腦的衰老過程中，代謝效率逐漸下降，使得神經(jīng)元更容易受到毒性損傷。當超過神經(jīng)元的承受閾值時，所有這些改變都可能導(dǎo)致病理性的變化，最終導(dǎo)致神經(jīng)退行性變(vandeVenetal.,2017)。圖1.2衰老與神經(jīng)退行性變之間的復(fù)雜平衡示意圖Figure1.2Aschematicofthecomplexbalancebetweenagingandneurodegeneration(Vannietal.,2020)1.1.3衰老相關(guān)因子（1）D-半乳糖（D-galactose，D-gal）：一種常見的單糖，內(nèi)源性的D-gal來自于外來食物攝取和機體自身合成。正常生理條件下，體內(nèi)維持D-gal正常濃度的動態(tài)平衡，但因某些病理因素引起的代謝異常，會導(dǎo)致D-gal在體內(nèi)過量積累。大量的D-gal在半乳糖氧化酶的催化作用下，會產(chǎn)生過氧化氫和醛糖，該產(chǎn)物又會刺激細胞，生成大量的自由基離子，從而進一步損傷細胞的生理功能(Hermansetal.,2019)。D-半乳糖是目前國內(nèi)外公認的致衰劑(AzmanandZakaria,2019)。衰老動物模型構(gòu)建廣泛是用D-半乳糖所建立的動物模型。外源性D-半乳糖是一種氧化性物質(zhì)，當其進入機體細胞后，還原成半乳糖醇，其中醛糖還原酶起到催化作用，因細胞無法將反應(yīng)產(chǎn)物代謝，進而使得其在細胞內(nèi)逐步堆積，此時引起蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等過氧化以及造成線粒體結(jié)構(gòu)上的損傷和功能上的紊亂。由于能量代謝發(fā)生障礙導(dǎo)致細胞衰老變化(RostamiDovometal.,2019)。

第1章引言51.1.4衰老細胞通路的研究進展衰老效應(yīng)的激活通路，雖然和應(yīng)激響應(yīng)信號的處理途徑有部分重合，但會因體內(nèi)環(huán)境而導(dǎo)致誘導(dǎo)衰老的分子有所變化。依賴于細胞周期蛋白激酶抑制劑水平升高，激活了RB信號通路，阻斷了正常細胞周期的進程。在細胞衰老時，TGF-β水平升高同時SMAD/FOXO活性降低，通過p21/p15Ink4b轉(zhuǎn)錄激活的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑。在胎盤中，當癌基因激活或失活腫瘤抑制因子p53信號后，會誘發(fā)p21和p16Ink4b，引發(fā)急性衰老。急性衰老是有益的，因為其會使這些惡性細胞可能被免疫系統(tǒng)迅速清除。但這種情況與慢性衰老存在區(qū)別，慢性衰老是對年齡緩慢累積的大分子損傷的一種反應(yīng)，如端粒侵蝕、蛋白質(zhì)毒性、DNA損傷等。慢性衰老的效應(yīng)物可能包括在衰老組織中誘導(dǎo)的p21和p16Ink4b。如果隨著年齡增長，免疫清除能力受損，慢性衰老也可能從急性衰老演變?yōu)槁运ダ希瑥亩鴮?dǎo)致長期的阻滯，并可能改變衰老相關(guān)的分泌表型(SASP)(Childsetal.,2015)。在衰老的所有情況下,細胞周期蛋白依賴性激酶相關(guān)活動，導(dǎo)致早期衰老狀態(tài)的形成。早期衰老細胞的β-半乳糖苷酶陽性，呈現(xiàn)出可逆轉(zhuǎn)的趨勢，之后則可能發(fā)展為不可逆的SASP和β-半乳糖苷酶陽性。細胞變化推動形成SASP具體機制至今尚不清楚,但可能包括如NF-κB依賴性和激活細胞周期基因的轉(zhuǎn)錄程序生成SASP等過程。圖1.3三種衰老細胞的效應(yīng)通路Figure1.3Threesenescentcelleffectorpathways(Childsetal.,2015)


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