琥珀酸是一種重要的平臺(tái)化合物,由于琥珀酸具有很大的應(yīng)用潛力,它被認(rèn)定為最重要的生物基大宗化學(xué)品之一。在大腸桿菌中提高琥珀酸合成的方法包括:阻斷競爭性途徑、激活乙醛酸支路、過表達(dá)琥珀酸生產(chǎn)的關(guān)鍵酶以及提高能量和還原當(dāng)量的供應(yīng)等。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建了一系列產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌,本文首次通過底物比例的調(diào)整,以及呼吸鏈的改造、ATP無效循環(huán)等一系列策略來調(diào)節(jié)菌株胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生和NADH/NAD+比例,達(dá)到提高琥珀酸產(chǎn)量和產(chǎn)率的目的。葡萄糖和木糖是纖維素水解液的主要成分,我們構(gòu)建的產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌YL104H可以以葡萄糖為底物高效的生產(chǎn)琥珀酸。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)YL104H也可以利用葡萄糖和木糖的混合糖來生產(chǎn)琥珀酸。然而,在發(fā)酵的厭氧階段以單一的木糖為底物時(shí)YL104H菌株不能積累琥珀酸,我們推測可能是由于以木糖作為底物時(shí)厭氧生產(chǎn)能量供應(yīng)不足導(dǎo)致的。通過分析以單一葡萄糖或單一木糖為底物時(shí)厭氧階段ATP的產(chǎn)生情況。我們發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)ATP的水平會(huì)影響琥珀酸的產(chǎn)量,通過簡單的調(diào)節(jié)底物中葡萄糖與木糖的比例就可以起到調(diào)節(jié)菌株胞內(nèi)ATP水平的作用。之前的研究都是通過增加ATP的供應(yīng)來提高琥珀酸的產(chǎn)量,本研究首次通過調(diào)... 

【文章來源】：山東大學(xué)山東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
本論文的縮寫詞表
第一章 緒論
    1.1 琥珀酸簡介
        1.1.1 琥珀酸的理化性質(zhì)
        1.1.2 琥珀酸的應(yīng)用及市場需求
        1.1.3 琥珀酸的合成方法
    1.2 生產(chǎn)琥珀酸的菌株
        1.2.1 天然生產(chǎn)宿主
        1.2.2 工程宿主菌
    1.3 利用代謝工程策略提高大腸桿菌合成琥珀酸的研究進(jìn)展
        1.3.1 提高大腸桿菌厭氧琥珀酸合成的研究進(jìn)展
        1.3.2 提高大腸桿菌有氧琥珀酸合成的研究進(jìn)展
    1.4 輔因子對琥珀酸生產(chǎn)的影響
        1.4.1 細(xì)胞氧化還原平衡
        1.4.2 胞內(nèi)ATP水平
    1.5 本論文的研究內(nèi)容及意義
第二章 利用葡萄糖和木糖比例調(diào)節(jié)胞內(nèi)ATP提高琥珀酸產(chǎn)量
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 寡核苷酸序列
        2.1.3 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常用酶
        2.1.4 本論文中所使用的試劑盒
        2.1.5 常用生化試劑與藥品
        2.1.6 培養(yǎng)基與主要試劑
        2.1.7 緩沖液以及主要試劑
        2.1.8 實(shí)驗(yàn)所用到的儀器和設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 菌種的保藏方法
        2.2.2 細(xì)菌基因組DNA的提取
        2.2.3 酵母基因組DNA的提取
        2.2.4 質(zhì)粒DNA提取
        2.2.5 PCR擴(kuò)增反應(yīng)
        2.2.6 PCR產(chǎn)物純化回收
        2.2.7 瓊脂糖凝膠產(chǎn)物的純化
        2.2.8 酶切體系和方法
        2.2.9 T4 DNA連接酶連接反應(yīng)體系
        2.2.10 體外組裝方法
    2.3 琥珀酸發(fā)酵條件
        2.3.1 種子活化
        2.3.2 四聯(lián)罐發(fā)酵
        2.3.3 3 L發(fā)酵罐發(fā)酵
    2.4 檢測方法
        2.4.1 菌體生長情況的測定
        2.4.2 葡萄糖的測定
        2.4.3 琥珀酸、木糖以及副產(chǎn)物的測定
        2.4.4 胞內(nèi)ATP的測定
        2.4.5 構(gòu)建YL104H菌株的代謝模型以及代謝流平衡分析（FBA）
    2.5 結(jié)果與討論
        2.5.1 不同碳源發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的性能比較
        2.5.2 分析厭氧發(fā)酵中工程菌株胞內(nèi)ATP的水平
        2.5.3 優(yōu)化混合糖比例來調(diào)節(jié)胞內(nèi)ATP水平提高琥珀酸產(chǎn)量
        2.5.4 利用優(yōu)化的混合糖發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸
    本章小結(jié)
+比例和ATP水平提高全階段琥珀酸產(chǎn)率">第三章 調(diào)節(jié)胞內(nèi)NADH/NAD⁺比例和ATP水平提高全階段琥珀酸產(chǎn)率
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌株和質(zhì)粒
        3.1.2 寡核苷酸序列
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 本實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒載體的構(gòu)建
        3.2.2 其他實(shí)驗(yàn)方法
    3.3 琥珀酸發(fā)酵條件
    3.4 檢測方法
+的測定">        3.4.1 胞內(nèi)NADH/NAD⁺的測定
        3.4.2 胞內(nèi)ATP的測定
        3.4.3 其他檢測方法
    3.5 結(jié)果與討論
        3.5.1 在雙階段發(fā)酵中一致化NADH脫氫酶提高全階段琥珀酸產(chǎn)率
        3.5.2 引入來自釀酒酵母的FRDS1對工程菌株琥珀酸發(fā)酵的影響
        3.5.3 引入?yún)捬魽TP無效循環(huán)對工程菌株琥珀酸發(fā)酵的影響
        3.5.4 共表達(dá)frd與ppsA基因來提高琥珀酸的產(chǎn)率
    本章小結(jié)
創(chuàng)新性成果
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
學(xué)位論文評閱及答辯情況表



本文編號(hào)：2942983