肌肉生長抑制素基因（Myostatin）是TGF-β家族中的一員,是一種分泌型糖蛋白。是可負(fù)調(diào)控肌肉生長發(fā)育的一種因子,主要在哺乳動物的骨骼肌中特異性表達(dá)。最近研究發(fā)現(xiàn),該基因的過表達(dá)可以導(dǎo)致動物的肌肉萎縮,而該基因的突變會使基因功能失活,從而引起動物肌肉纖維數(shù)和直徑增加,出現(xiàn)明顯的"雙肌"性狀。蒙古牛作為內(nèi)蒙古地區(qū)高原特色物種,存在產(chǎn)肉率低等問題,所以,培育出性狀優(yōu)良、產(chǎn)肉率高的蒙古牛對于內(nèi)蒙古地區(qū)的種質(zhì)資源保護(hù)及優(yōu)化、遺傳育種、經(jīng)濟(jì)增長等具有重要意義。同時(shí)對于醫(yī)學(xué)研究利用基因編輯技術(shù)治療與肌肉生長發(fā)育相關(guān)的疾病也具有重要意義。本研究的目的是設(shè)計(jì)并建立一個(gè)安全且無任何篩選標(biāo)記編輯MSTN的CRISPR/Cas9載體;同時(shí)通過組織塊貼壁法對妊娠45天的蒙古牛胎兒建立皮膚成纖維細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)中,根據(jù)蒙古牛的MSTW第二外顯子基因序列,設(shè)計(jì)并構(gòu)建了 3個(gè)無標(biāo)記CRISPR/Cas9載體,分別為:C1,C2,C3,經(jīng)測序和體內(nèi)活性檢測,載體C1構(gòu)建正確且具有生物活性,可用于后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。通過電轉(zhuǎn)染方法將構(gòu)建好的載體C1轉(zhuǎn)染到蒙古牛胎兒成纖維細(xì)胞中,通過無限稀釋法和口吸管法接種單細(xì)胞,擴(kuò)繁后... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1 引言
    1.1 肌肉生長抑制素基因的研究進(jìn)展
        1.1.1 MSTN的發(fā)現(xiàn)
        1.1.2 MSTN的結(jié)構(gòu)
        1.1.3 MSTN的特異性
        1.1.4 MSTN的生物學(xué)功能
        1.1.5 MSTN的應(yīng)用與前景
    1.2 人工核酸酶基因靶向編輯技術(shù)的發(fā)展
        1.2.1 鋅指核酸酶技術(shù)
        1.2.2 類轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)
        1.2.3 CRISPR/Cas9技術(shù)
        1.2.4 NgAgo-gDNA技術(shù)
    1.3 轉(zhuǎn)基因生物安全性
    1.4 本文研究的目的和意義
2 編輯蒙古牛MSTN基因CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑配制方法
    2.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法
        2.2.1 編輯蒙古牛MSTN基因CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建
        2.2.2 載體的活性檢測
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        2.3.1 CRISPR/Cas9質(zhì)粒圖譜
        2.3.2 細(xì)胞基因組PCR結(jié)果
        2.3.3 載體活性檢測結(jié)果
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
3 蒙古牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞系的建立
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑配制方法
    3.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法
        3.2.1 蒙古牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)
        3.2.2 蒙古牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)
        3.2.3 蒙古牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞凍存和復(fù)蘇
        3.2.4 蒙古牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞生長曲線的測定
        3.2.5 蒙古牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的染色體數(shù)目分析
        3.2.6 蒙古牛胎兒的性別鑒定
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        3.3.1 蒙古牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)
        3.3.2 蒙古牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)
        3.3.3 蒙古牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞生長曲線的測定
        3.3.4 蒙古牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞的染色體數(shù)目分析
        3.3.5 蒙古牛胎兒的性別鑒定
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
4 無標(biāo)記編輯蒙古牛MSTN基因成纖維細(xì)胞株的建立
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材
        4.1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑配制方法
    4.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法
        4.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件摸索
        4.2.2 無標(biāo)記編輯蒙古牛MSTN基因成纖維細(xì)胞株的建立
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        4.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件摸索
        4.3.2 CRISPR/Cas9載體與成纖維細(xì)胞共轉(zhuǎn)染結(jié)果
        4.3.3 單細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果
        4.3.4 單細(xì)胞株鑒定結(jié)果
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
5 總體結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄
作者簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：2941936