目的:本研究選擇Notch信號配體Delta-like基因,建立穩(wěn)定表達(dá)外源Dll1、Dll3及Dll4基因的MLO-Y4骨細(xì)胞株,研究骨細(xì)胞Notch信號Delta-like類配體Dll1、Dll3及Dll4對骨髓基質(zhì)細(xì)胞（Bone marrow Stromal cell,BMSC）成骨分化的影響,明確Notch信號Delta-like配體是否具有促成骨作用,以揭示骨細(xì)胞Smad4促進(jìn)骨形成的分子機(jī)制。方法:（1）采用基因克隆技術(shù)制備慢病毒過表達(dá)Dll1、Dll3及Dll4基因的載體,將三個目的基因分別克隆至慢病毒過表達(dá)載體pLent-GFP-PURO-cmv（Flag）。（2）將慢病毒過表達(dá)載體與慢病毒包裝系統(tǒng)質(zhì)粒（psPAX2、pMD2.G）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,獲得的慢病毒原液感染MLO-Y4樣骨細(xì)胞,嘌呤霉素篩選分別穩(wěn)定表達(dá)Dll1、Dll3及Dll4基因的MLO-Y4樣骨細(xì)胞。并采用實(shí)時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,QPCR）對篩選出來的MLO-Y4樣骨細(xì)胞中Dll1、Dll3及Dll4基因的表達(dá)進(jìn)行鑒定。（3）將三種穩(wěn)定表達(dá)Delta... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

Delta-like基因重組慢病毒過表達(dá)載體電泳結(jié)果

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文33圖3.2Delta-like基因重組慢病毒過表達(dá)載體測序結(jié)果。（A）、（B）和（C）分別為pLent-GFP-Dll1、Dll3及Dll4部分測序峰圖。注：（A）：pLent-GFP-Dll1；（B）：pLent-GFP-Dll3；（C）：pLent-GFP-Dll4Fig.3.2ThesequencingresultsforrecombinantlentivirusoverexpressionvectorofDelta-likegenes.(A),(B)and(C)arepartialsequencingpeaksofpLent-GFP-Dll1,Dll3andDll4,respectively.Note:(A):pLent-GFP-Dll1;(B):pLent-GFP-Dll3;(C):pLent-GFP-Dll43.2Delta-like重組慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒的包裝及滴度測定采用三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)將重組慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒（psPAX2、pMD2.G）共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24h后在熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)。轉(zhuǎn)染后48h均出現(xiàn)綠色熒光，說明重組慢病毒質(zhì)粒包裝成功（圖3.3）。48h和96h左右收集病毒上清液并濃縮，測得Dll1、Dll3及Dll4慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒離心濃縮后的滴度分別為1×107、3×107、3×107pfu/mL，對照質(zhì)粒達(dá)到2×108pfu/mL。

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文35圖3.4不同MOI值的重組過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染MLO-Y4細(xì)胞的效率（100×）。Dll1、Dll3、Dll4及對照質(zhì)粒慢病毒分別以20、60、100、120的MOI值轉(zhuǎn)染MLO-Y4細(xì)胞，72h后在熒光顯微鏡下觀察到GFP在細(xì)胞中表達(dá)。（A）、（B）、（C）和（D）分別為pLent-GFP-control、Dll1、Dll3及Dll4。注：（A）：pLent-GFP-control；（B）：pLent-GFP-Dll1；（C）：pLent-GFP-Dll3；（D）：pLent-GFP-Dll4Fig.3.4TheefficiencyofrecombinantoverexpressionlentivirustransfectingMLO-Y4cellswithdifferentMOIvalues(100×).ThelentivirusesofDll1,Dll3,Dll4andcontrolplasmidsweretransfectedintoMLO-Y4cellswithMOIvaluesof20,60,100,120andGFPwasobservedinthesecellsunderafluorescencemicroscope72hourslater.(A),(B),(C)and(D)arepLent-GFP-control,Dll1,Dll3andDll4,respectively.Note:(A):pLent-GFP-control;(B):pLent-GFP-Dll1;(C):pLent-GFP-Dll3;(D):pLent-GFP-Dll4選擇MOI值為120的慢病毒轉(zhuǎn)染接種于六孔板的MLO-Y4細(xì)胞，72h后觀察到綠色熒光。3個目的基因過表達(dá)慢病毒及對照慢病毒的轉(zhuǎn)染率均在80%以上（圖3.5）。用含嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基篩選10d后獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽性MLO-Y4細(xì)胞。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Smad4促進(jìn)成骨分化的機(jī)制研究[J]. 劉俊銀,馮瑋,涂小林.  中國骨質(zhì)疏松雜志. 2019(05)



本文編號：2906904