發(fā)布時間：2020-11-19 13:10

　　 腸道病毒D68型(EV-D68)屬小核糖核酸病毒科腸道病毒屬,屬于無包膜的單股正鏈RNA病毒。1962年從加利福尼亞兒童咽拭子中首次分離,可引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病及兒童呼吸系統(tǒng)疾病,并且呼吸系統(tǒng)疾病在臨床更為常見。近年來,EV-D68在全世界的多個國家或地區(qū)爆發(fā),目前并無特效藥物及疫苗。脂筏(lipid raft)位于細胞膜上,其中成份包括豐富的鞘磷脂與膽固醇,并且較為廣泛的分布于細胞的膜系統(tǒng)。在細胞內(nèi)外因素的影響下,脂筏可動態(tài)性和選擇性地募集宿主蛋白,參與細胞的多種生物學功能。包膜病毒在感染宿主細胞時,首先通過其包膜與宿主細胞的細胞膜進行融合,從而將病毒基因組釋放至宿主細胞內(nèi)。病毒將通過表面的糖蛋白分子與細胞膜上的蛋白受體結(jié)合并且在受體的介導下以內(nèi)吞的方式進入細胞,而脂筏在多種病毒如HIV-1、流感病毒和人類皰疹病毒-6(human herps virus 6,HHV-6)等的侵入、裝配和釋放過程中起重要作用。病毒在與宿主細胞膜受體結(jié)合的同時也會激活與受體偶聯(lián)的相關(guān)細胞信號分子,從而激活相關(guān)的信號通路參與宿主細胞的各種生理過程,而且有些病毒就是通過脂筏來參與相關(guān)的信號傳導。關(guān)于脂筏在EV-D68感染中的作用,尚未見相關(guān)文獻報道。為探討脂筏在EV-D68感染細胞中的作用,并最終為闡明EV-D68致病的分子機理及尋找新的抗病毒靶點提供依據(jù),我們完成了如下研究。一、用甲基-β-環(huán)糊精(methyl-β-cyclodextrin,MβCD)去除部分維持脂筏穩(wěn)定性的膽固醇分子來破壞宿主細胞膜脂筏結(jié)構(gòu),可抑制EV-D68進入并使病毒滴度降低;而在病毒進入過程中補充外源膽固醇可逆轉(zhuǎn)MβCD去除細胞膜膽固醇對EV-D68進入的抑制作用,表明脂筏與EV-D68的進入和復制密切相關(guān)。二、使用qRT-PCR檢測脂筏對病毒吸附和進入的影響,發(fā)現(xiàn)破壞脂筏抑制病毒的進入作用,并且在補充外源膽固醇后病毒的進入作用有所恢復。三、應(yīng)用Western blot檢測提取的脂筏組分,發(fā)現(xiàn)EV-D68與脂筏標志蛋白有共同定位,證明EV-D68可以通過脂筏結(jié)構(gòu)進入細胞。四、MβCD可將細胞脂筏組分驅(qū)散,其標志蛋白、病毒以及非脂筏區(qū)域標志蛋白有共同定位,說明EV-D68將通過非脂筏區(qū)域進入細胞。五、共聚焦顯微鏡方法檢測到使用MβCD處理細胞后,病毒進入過程中內(nèi)吞小泡的酸化受到影響。六、破壞脂筏抑制EV-D68流行株的感染。綜上,本研究發(fā)現(xiàn)脂筏參與EV-D68的進入及內(nèi)吞小泡的酸化,破壞脂筏后內(nèi)吞小泡的形成可能受到影響,干擾病毒基因組的釋放,從而干擾病毒生命周期,而破壞脂筏后EV-D68通過非脂筏區(qū)域進入細胞。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：R373.2
【部分圖文】：

第1章緒論1第1章緒論1.1腸道病毒D68型的研究進展腸道病毒D68型（EV-D68）屬小核糖核酸病毒科，1962年首次從加州兒童口咽拭子中分離和鑒定[1]，并確定了四種不同的病毒株：Fermon,Franklin,Robison,andRhyne。近年來，新的代表性毒株逐漸出現(xiàn)，例如US/MO/14-18947（MO），US/KY/14-18953（KY）等。EV-D68主要引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及兒童的呼吸系統(tǒng)疾病，并且呼吸系統(tǒng)疾病在臨床最為常見[3,4,7,8]。以前有關(guān)EV-D68感染的相關(guān)報道很少，但自2005年以來，它在美國、亞洲和歐洲經(jīng)歷了全球性的爆發(fā)，在過去的15年中發(fā)病率不斷增加，并且威脅到全球公共衛(wèi)生安全[2,6,9,11]。1.1.1EV-D68基因組結(jié)構(gòu)EV-D68的基因組包含約7.6kb的單正鏈RNA。EV-D68包含一個單一的開放閱讀框（ORF），其兩端分別帶有非翻譯區(qū)（UTR）[5]，編碼一種前體蛋白，并且可進一步自動催化裂解產(chǎn)生四種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1，VP2，VP3和VP4）和七種非結(jié)構(gòu)蛋白（2A，2B，2C，3A，3B，3C和3D）（圖1）[5]。圖1.腸道病毒D68基因組的示意圖。1.1.2EV-D68的感染機制病毒是一種必須在活細胞內(nèi)才能生存的微生物，在進入細胞前必須通過與細胞表面的受體蛋白結(jié)合，隨后在受體蛋白的介導下進入細胞。有研究表明，唾液酸（SialicAcid）可能是EV-D68的受體蛋白[12,15,18]。研究人員通過使用神經(jīng)氨酸酶（NA）處理HeLa細胞經(jīng)后僅有約10%的EV-D68吸附在細胞表面，

第 3 章 實驗結(jié)果與討論 第 3 章 實驗結(jié)果與討論 3.1 藥物使用濃度的確定 通過 MTS 實驗確定甲基-β-環(huán)糊精（MβCD）對細胞的毒性濃度。使用 10mM MβCD 可將膽固醇成分降低至 35%，可有效破壞脂筏結(jié)構(gòu)[29]。結(jié)合 MTS 實驗結(jié)果確定使用藥物使用濃度范圍為 0mM-10mM（圖 3.1）。

脂筏結(jié)構(gòu)對EV-D68感染性的影響檢測Fig.3.2DetectionoftheeffectoflipidraftstructureonEV-D68
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本文編號：2890051