多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是一種由2個或2個以上苯環(huán)以線狀、角狀或簇狀組成的烴類化合物,因其具有強烈的致癌、致畸、致突變作用,對環(huán)境和人類健康造成較大危害。微生物去除PAHs具有快速、低價、無二次污染等優(yōu)點,是土壤PAHs去除的主要途徑。硝酸鹽具有較高的氧化還原電勢,即可以為土壤微生物生長提供所必須的氮源,又可以作為土壤反硝化微生物的電子受體。土壤中的反硝化微生物在70多個屬中均有分布,且早有研究表明,土壤中PAHs的降解可以與反硝化細菌所驅(qū)動的反硝化過程相偶聯(lián),但目前土壤反硝化微生物對PAHs污染的響應(yīng)機制還少有報道。因此,本研究以具有50多年歷史的江漢油田區(qū)域土壤為研究對象,從該油田的油井口附近采集9個土壤樣品,編號為JH-1至JH-9,測定各土壤樣品的基本理化性質(zhì)及PAHs含量的同時,以反硝化功能基因narG(硝酸鹽還原酶基因)、nirK(Cu-亞硝酸還原酶基因)和nirS(細胞色素cd1-亞硝酸還原酶基因)為分子標識,通過熒光定量-PCR和限制性末端片段長度多態(tài)性分析(terminal-restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)的方法來檢測各樣品中反硝化相關(guān)功能基因的豐度及群落結(jié)構(gòu),進而探討土壤反硝化微生物對土壤環(huán)境因子及PAHs含量的響應(yīng)機制。隨后,通過厭氧微宇宙培養(yǎng)實驗進一步研究反硝化細菌活性與豐度對典型PAHs(芘)污染的響應(yīng),并通過Illumina Miseq測序的方法研究添加硝酸鹽和芘對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響。全面探討土壤反硝化細菌對PAHs污染的響應(yīng)機理,以期為進一步深入探究PAHs污染與土壤反硝化過程的相互關(guān)系打下基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1)江漢油田區(qū)直接采集的農(nóng)田土壤樣品的調(diào)查結(jié)果表明,土壤PAHs含量在0.21~8.10mg·kg-1之間,污染程度較低。定量-PCR的結(jié)果表明,PAHs含量最高的土壤樣品(JH-4)中反硝化功能基因narG的豐度也最高,相關(guān)性分析表明,該油田區(qū)土壤中narG型微生物豐度與土壤PAHs含量成正相關(guān)關(guān)系(R2=0.58,P0.05);與此相反,PAHs含量最高的土壤樣品(JH-4)中反硝化功能基因nirK和nirS的豐度均最低,相關(guān)性分析表明,土壤nirK及nirS基因的豐度均與土壤PAHs含量呈顯著負相關(guān)(nirK:R2=0.54,P0.05;nirS:R2=0.58,P0.05)�？寺∥膸旒癟-RFLP的結(jié)果則表明,該油田土壤中nirK基因的群落組成在不同樣品間的變異較大,且PAHs含量最高的JH-4中該基因的群落組成與其它各樣品有明顯的不同,冗余分析(redundancy analysis,RDA)的結(jié)果進一步表明除有效氮、有效磷外,土壤PAHs含量也是影響nirK型反硝化微生物群落組成的重要因子。相較于nirK,該油田區(qū)土壤中nirS基因的群落組成在不同樣品間的差異較小,但發(fā)現(xiàn)nirS型假單胞菌的豐度與土壤PAHs含量呈正相關(guān),表明具備較強有機污染物降解能力的假單胞菌屬可能在該區(qū)域土壤PAHs的反硝化代謝中起到重要作用。2)在研究內(nèi)容1的基礎(chǔ)上,選擇一個相對干凈的土壤樣品(JH-9)作為研究對象,通過添加硝酸鹽和芘(典型的4環(huán)PAHs,常被作為檢測PAHs污染的指示物和其它PAHs生物降解的模型分子)的微宇宙培養(yǎng)實驗,進一步研究土壤反硝化細菌的豐度和活性對PAHs污染的響應(yīng)。本實驗設(shè)置添加30 mg·kg-1硝酸鹽(N30)和不加硝酸鹽(N0)兩個處理,每個處理包含3個不同的芘濃度(0,30,60 mg·kg-1,分別用P0,P30,P60表示),共6個處理,分別用N0P0,N0P30,N0P60,N30P0,N30P30和N30P60表示,在厭氧條件下培養(yǎng)45天,并在培養(yǎng)第3,14,28,45天取樣測量土壤的PAHs含量,N2O,CO2產(chǎn)生速率和相關(guān)反硝化功能基因豐度。實驗結(jié)果表明,培養(yǎng)后期(45天),土壤中芘的總降解率在26.14%~43.03%之間,且芘的初始濃度越高,其降解率也越高,但在厭氧培養(yǎng)過程中硝酸鹽的添加對芘的降解無顯著影響。此外,對土壤N2O產(chǎn)生速率的研究表明,各樣品只在培養(yǎng)初期(3天)檢測到N2O的釋放,其含量在122.82~379.22μg·kg-1·h-1之間,且硝酸鹽的添加對土壤N2O的產(chǎn)生速率有顯著的促進作用。對微生物活性的測定表明,在培養(yǎng)第3,7和14天的CO2產(chǎn)生速率在各處理土壤間無顯著差別,但在培養(yǎng)后期(45天),添加硝酸鹽的處理中CO2的產(chǎn)生速率顯著高于未添加硝酸鹽的處理。此外,定量PCR的結(jié)果表明,在培養(yǎng)過程中,反硝化相關(guān)基因的豐度呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢,但硝酸鹽和芘的添加對反硝化功能基因的豐度無顯著影響。3)為了進一步研究厭氧條件下添加硝酸鹽和芘對細菌群落結(jié)構(gòu)的影響,在研究2的基礎(chǔ)上,選擇微宇宙培養(yǎng)45天的4個代表性土壤處理((N0P0、N0P60、N30P0、N30P60),通過Illumina miseq測序技術(shù)解析土壤樣品中的細菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,添加硝酸鹽和芘的處理中土壤的多樣性指數(shù)(Chao1,shannon)均略高于未添加硝酸鹽和芘的處理N0P0。在門水平上對微生物群落組成分析發(fā)現(xiàn),Actinobacteria(放線菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)和Proteobacteria(變形菌門)細菌為本研究土壤的優(yōu)勢細菌類群。進一步分析發(fā)現(xiàn),未添加硝酸鹽的處理(N0P0、N0P60)有相似的細菌群落組成,但與添加硝酸鹽的處理各細菌門在豐度存在明顯不同。與不添加硝酸鹽的處理相比,添加硝酸鹽使放線菌門的細菌豐度顯著減少,而變形菌門細菌的豐度增加。對放線菌門和變形菌門細菌在屬水平的進一步分析發(fā)現(xiàn),這4個處理在變形菌門和放線菌門屬水平上具有相同的細菌種類,但是添加硝酸鹽和未添加硝酸鹽的處理在各細菌屬的比例上卻有顯著差異。由此可見,在厭氧條件下,芘對微生物群落結(jié)構(gòu)無顯著影響,但硝酸鹽是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：X53;S154.3
【部分圖文】：

第 1 章 文獻綜述硝化過程化作用是氮循環(huán)里的一個重要環(huán)節(jié)，和硝化作用以及生物固氮等作用共同素的循環(huán)。反硝化作用又稱脫氮作用，是指反硝化微生物在一定條件下，逐步還原，最終將氮以一氧化氮（NO）、氧化亞氮（N2O）或分子態(tài)氮（N的過程。細菌的反硝化過程如圖 1-1 所示，該過程是由一系列酶催化反應(yīng)發(fā)分別是硝酸鹽還原酶（nitrate reductase, Nar）、亞硝酸鹽還原酶（nitrite reduc還原酶（nitric oxidereductase, Nor）和氧化亞氮還原酶（nitrous oxide reducpot et al., 2002a），這些酶通常是在厭氧條件下被順序誘導(dǎo)產(chǎn)生�？傮w來說，示為以下還原反應(yīng)：2NO3 +10e-+12H+→N2+6H2O（Tavares et al., 2006）。

物關(guān)系的研究還不多見。因此，本研究選擇具有 50 多年歷史的江漢油田區(qū)域農(nóng)田土壤為研對象，以反硝化的功能基因 narG、nirK 及 nirS 為分子標識，利用定量-PCR 及克隆文庫結(jié)T-RFLP 的方法，來探討該油田區(qū)域土壤 PAHs 含量等環(huán)境因子與反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)之的關(guān)系，可為進一步深入研究土壤 PAHs 反硝化降解的微生物機理提供一定的理論依據(jù)。3.1 材料與方法3.1.1 土壤樣品的采集江漢油田位于湖北省的潛江市（112°29′E~113°01′E，30°04′N~30°49′N）境內(nèi)，已有 5年的油氣開發(fā)歷史，是新中國最早開發(fā)的油氣田之一。本研究的土壤樣品在 2014 年 7 月采于江漢油田區(qū)域不同出油井附近的農(nóng)田表層（0~20 cm），以水稻-油菜輪作形式耕種。共選了九個采樣點，編號為 JH-1~JH-9，在每個采樣點中心周圍 30 m2的范圍內(nèi)，隨機選擇 9 個進行多點混合并初步剔除石塊和雜物，以完成單個土樣的采集，每個樣品設(shè)置 3 次重復(fù)，體采樣點的地理信息如下圖 3-1 所示。采集好的樣品裝于自封袋后，置于放有冰袋的箱子中回實驗室。隨后，過 2 mm 篩后分裝，部分保存于 4 ℃用于基本性質(zhì)測定，部分置于-20 ℃箱用于 DNA 的提取，剩余部分風(fēng)干后用于有機質(zhì)等的測定。

圖 3-2a 土壤 narG 基因克隆文庫驗證的 PCR 電泳圖Pig 3-2a The PCR electrophoregram of soil narG gene cloning library validation圖 3-2b 土壤 nirK 基因克隆文庫驗證的 PCR 電泳圖Pig 3-2b The PCR electrophoregram of soil nirK gene cloning library validation
【參考文獻】

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2 鄧紹坡;吳運金;龍濤;林玉鎖;祝欣;;我國表層土壤多環(huán)芳烴(PAHs)污染狀況及來源淺析[J];生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報;2015年06期

3 師陽;孫玉川;梁作兵;任坤;袁道先;;重慶金佛山土壤中PAHs含量的海拔梯度分布及來源解析[J];環(huán)境科學(xué);2015年04期

4 孫萍;高永超;張強;黃玉杰;遲建國;邱維忠;王加寧;;多環(huán)芳烴污染土壤微生物修復(fù)技術(shù)[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年19期

5 劉近;鄧代永;孫國萍;劉永定;許玫英;;硝酸鹽對沉積物中有機物氧化減量及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響[J];環(huán)境科學(xué);2013年07期

6 吳艷陽;吳群河;黃珊;葉嘉欣;張恒軍;張仁鐸;;沉積物中多環(huán)芳烴對反硝化功能基因垂直分布的影響[J];環(huán)境科學(xué);2012年10期

7 孫明明;滕應(yīng);駱永明;;厭氧微生物降解多環(huán)芳烴研究進展[J];微生物學(xué)報;2012年08期

8 吳彬彬;盧滇楠;劉錚;;石油污染土壤生物修復(fù)過程中氮循環(huán)功能基因的動態(tài)檢測[J];環(huán)境科學(xué);2012年06期

9 郭麗蕓;時飛;楊柳燕;;反硝化菌功能基因及其分子生態(tài)學(xué)研究進展[J];微生物學(xué)通報;2011年04期

10 劉增俊;滕應(yīng);黃標;李振高;駱永明;;長江三角洲典型地區(qū)農(nóng)田土壤多環(huán)芳烴分布特征與源解析[J];土壤學(xué)報;2010年06期

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3 高亞潔;受多環(huán)芳烴（PAHs）污染底泥的修復(fù)研究[D];天津大學(xué);2012年

4 馮琪;厭氧條件下初始NO_3~-含量對土壤反硝化氣體（N_2、N_2O和NO）和CO_2排放的影響[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

本文編號：2889217