MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物基因組內(nèi)數(shù)量龐大、功能多樣化的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,廣泛地參與植物體的苯丙烷類物質(zhì)代謝調(diào)控、細(xì)胞形態(tài)建成調(diào)控、細(xì)胞周期循環(huán)調(diào)控以及對逆境脅迫做出應(yīng)答等生理活動,在植物生長發(fā)育和抵御逆境的過程中發(fā)揮著不可替代的作用。苯丙烷代謝是植物體一條非常重要的次生代謝途徑,所有包含苯丙烷骨架的化合物都是通過這條代謝途徑生成的。苯丙烷類物質(zhì)代謝出現(xiàn)在維管植物發(fā)生分離之前,單子葉植物與雙子葉植物之間某些苯丙烷類衍生物的代謝具有進化上的保守性。苯丙烷類衍生物在植物抵御微生物入侵、環(huán)境脅迫等過程中發(fā)揮重要作用；木質(zhì)素作為保護植物細(xì)胞壁的天然屏障,賦予細(xì)胞壁機械強度和硬度的同時為植物提供疏水的維管系統(tǒng),參與植物抵御真菌性病害脅迫的過程、增強植物抗倒伏及抗旱能力；花青素可清除植物體內(nèi)因逆境脅迫而積累的活性氧及自由基,保護植物免受因逆境脅迫而造成的氧化性損傷；原花青素積累在種子的種皮中,能加固種皮、誘導(dǎo)種子進行冬眠、防御病原菌脅迫,保護種子不受物理及生物傷害；黃酮醇能夠吸收紫外光,發(fā)揮“紫外光過濾器”的作用,防止植物體及光合作用器官受到紫外光的輻射等。玉米是我國第一大作物,深入研究玉米苯丙烷代謝途徑對于通過分子手段選育高抗、優(yōu)質(zhì)玉米品種具有重要意義,但是玉米中苯丙烷代謝途徑的研究遠(yuǎn)滯后于雙子葉植物。擬南芥等雙子葉植物中的R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛的參與類黃酮、木質(zhì)素等苯丙烷類衍生物的調(diào)控,為玉米中苯丙烷代謝調(diào)控的研究提供重要信息。同時本課題組前期對玉米基因組中158個R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子的分布規(guī)律及進化機制進行了研究,并通過同源性分析、共表達分析、線性分析等方法篩選到苯丙烷代謝途徑中高度保守的R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子基因,可能參與苯丙烷類衍生物代謝的調(diào)控。本研究以玉米優(yōu)良自交系B73為材料,從中克隆到兩個R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子ZmMYB111和ZmMYB148,并對其功能進行了初步研究；研究結(jié)果表明,ZmMYB111和ZmMYB148可能通過激活苯丙烷代謝途徑限速酶PAL的活性來調(diào)控玉米中苯丙烷類衍生物的合成,但是具體影響到哪一種苯丙烷類衍生物還需進一步研究。本研究具體結(jié)果如下：1、克隆ZmMYB111和ZmMYB148基因,得到了完整的開放閱讀框。對ZmMYB111和ZmMYB148蛋白的高級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析,結(jié)果表明ZmMYB111和ZmMYB148具有典型的R2R3MYB蛋白的二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域。將ZmMYB111和ZmMYB148與擬南芥等植物中調(diào)控苯丙烷代謝的R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建親緣進化樹(NJ樹)并對其保守基序進行分析,結(jié)果表明ZmMYB111和ZmMYB148與其他調(diào)控苯丙烷代謝的R2R3MYB有較近的親緣關(guān)系并含有保守的基序。2、實時定量PCR分析ZmMYB111和ZmMYB148在不同組織中的表達情況。結(jié)果表明ZmMYB111在苗期葉片、莖稈的髓部、雌花中幾乎不表達,在成熟期葉、苗期根、雄花中表達量較低,在成熟期根、胚乳、成熟種子中表達量中等,莖桿上部表達量較高,莖稈下部表達量最高；ZmMYB148在苗期葉片、莖稈的髓部、雌花中幾乎不表達,在成熟期葉、雄花中表達量較低,在苗期根、莖桿上部、成熟種子中表達量中等,在成熟期根、莖稈下部表達量較高,玉米胚乳中表達量最高。3、利用酵母轉(zhuǎn)化實驗分析ZmMYB111和ZmMYB148是否具有轉(zhuǎn)錄激活活性。結(jié)果顯示PGBDKT7-111和PGBDKT7-148可以在SD/-Trp/-His/3-AT/X-a-gal的缺陷型培養(yǎng)基上生長,說明ZmMYB111和ZmMYB148都具有轉(zhuǎn)錄激活活性。4、基因槍轟擊洋蔥表皮細(xì)胞對ZmMYB111和ZmMYB148蛋白亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明ZmMYB148定位在細(xì)胞核中,可能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達；ZmMYB111主要定位在細(xì)胞核中,但是細(xì)胞膜上也有少量熒光,說明ZmMYB111可能除了在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達之外,也許還參與細(xì)胞膜的保護或者膜蛋白的轉(zhuǎn)運等過程。5、克隆苯丙烷代謝途徑中關(guān)鍵酶基因苯丙氨酸解氨酶(PAL)、4-香豆酸COA連接酶(4CL)的啟動子pPAL、p4CL,利用酵母單雜交實驗驗證克隆的轉(zhuǎn)錄因子與pPAL、p4CL在玉米體外是否可以結(jié)合。結(jié)果表明ZmMYB111和ZmMYB148可以與pPAL、p4CL結(jié)合,而且ZmMYB148與pPAL、p4CL結(jié)合能力比ZmMYB111與pPAL、 p4CL結(jié)合能力強。6、PAL是苯丙烷代謝途徑的限速酶,為了進一步驗證ZmMYB111和ZmMYB148與pPAL的結(jié)合及對pPAL活性的影響(激活或抑制),利用基因槍轟擊玉米胚乳細(xì)胞進行瞬時表達實驗。結(jié)果表明ZmMYB111和ZmMYB148在玉米胚乳中可以與pPAL結(jié)合,增加pPAL的活性；并且ZmMYB148對pPAL的激活作用比ZmMYB111強,該結(jié)果與酵母單雜交實驗結(jié)果一致。
【學(xué)位單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：Q943.2
【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮寫表
1 文獻綜述
    1.1 MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究進展
        1.1.1 MYB轉(zhuǎn)錄因子的特征及分類
        1.1.2 MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能及調(diào)控機制
    1.2 苯丙烷類物質(zhì)代謝的研究進展
        1.2.1 苯丙烷類物質(zhì)代謝的起源
        1.2.2 苯丙烷類衍生物在植物體內(nèi)的合成途徑
        1.2.3 苯丙烷類衍生物在植物體內(nèi)的重要作用
    1.3 MYB轉(zhuǎn)錄因子對苯丙烷類物質(zhì)代謝的調(diào)控
        1.3.1 MYB轉(zhuǎn)錄因子對木質(zhì)素代謝的調(diào)控
        1.3.2 MYB轉(zhuǎn)錄因子對類黃酮代謝的調(diào)控
    1.4 本研究的意義及主要內(nèi)容
        1.4.1 本研究的意義
        1.4.2 本研究的主要內(nèi)容
2 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株及載體
        2.1.3 酶及試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 生物信息學(xué)軟件
        2.2.2 ZmMYB111和ZmMYB148基因的克隆
        2.2.3 ZmMYB111和ZmMYB148的組織特異性表達分析
        2.2.4 ZmMYB111和ZmMYB148轉(zhuǎn)錄激活活性分析
        2.2.5 ZmMYB111和ZmMYB148的亞細(xì)胞定位
        2.2.6 苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵酶基因啟動子的克隆
        2.2.7 酵母單雜交實驗
        2.2.8 瞬時表達實驗
3 實驗結(jié)果與分析
    3.1 MYB轉(zhuǎn)錄因子的克隆及生物信息學(xué)分析
        3.1.1 ZmMYB111和ZmMYB148的克隆
        3.1.2 ZmMYB111和ZmMYB148的序列及蛋白結(jié)構(gòu)分析
        3.1.3 Zm MYB111和ZmMYB148的系統(tǒng)進化樹構(gòu)建及保守基序分析
    3.2 ZmMYB111和ZmMYB148的組織特異性表達分析
        3.2.1 RNA提取結(jié)果
        3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        3.2.3 ZmMYB111和ZmMYB148在不同組織中表達情況
    3.3 ZmMYB111和ZmMYB148的轉(zhuǎn)錄激活活性分析
    3.4 ZmMYB111和ZmMYB148的亞細(xì)胞定位
    3.5 苯丙烷代謝途徑中關(guān)鍵酶基因啟動子的克隆
    3.6 酵母單雜交實驗
    3.7 瞬時表達實驗
        3.7.1 苯丙氨酸解氨酶PAL的組織特異性表達
        3.7.2 苯丙氨酸解氨酶PAL啟動子體外活性檢測
        3.7.3 瞬時表達實驗
4 討論與結(jié)論
    4.1 討論
        4.1.1 ZmMYB111和ZmMYB148具有R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子的基本特征
        4.1.2 ZmMYB111和ZmMYB148可能參與苯丙烷代謝的調(diào)控
        4.1.3 瞬時表達實驗方法及受體材料的選擇
    4.2 結(jié)論
參考文獻
附錄
    附錄1：實驗中所用載體圖譜
    附錄2:實驗中所用培養(yǎng)基配方
    附錄3：構(gòu)建進化樹基因登錄號
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄

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本文編號：2879020