目的:探討甘油二酯激酶ζ(diacylglycerol kinaseζ,DGKζ)、蛋白激酶CβⅡ(protein kinase CβⅡ,PKCβⅡ)在不同毛色小鼠背部皮膚中的表達、定位及其與毛色形成的相關(guān)性。方法:1.通過美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)官網(wǎng),獲取人和小鼠DGKζ的序列;運用多種在線生物信息學分析平臺對人DGKζ在各器官組織中的表達及其轉(zhuǎn)錄因子、編碼產(chǎn)物的信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細胞定位預測分析,并對人DGKζ的同源性進行分析;對小鼠DGKζ序列啟動子所結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子進行預測。2.取2M白、灰和黑色小鼠各6只,去毛取背部皮膚,行Real-time PCR、Western blotting和免疫組織化學ABC法染色技術(shù)檢測。結(jié)果:1.生物信息學分析結(jié)果表明:DGKζ在人體皮膚中表達;預測的人DGKζ啟動子可能結(jié)合的22個轉(zhuǎn)錄因子中ER-alpha、Sp1、p53、c-ets-1和YYY1這5個轉(zhuǎn)錄因子在黑素細胞中表達;人DGKζ編碼產(chǎn)物不存在信號肽剪切位點屬非分泌蛋白,無跨膜區(qū)域;主要定位于細胞核,亦定位在細胞質(zhì);人與黑猩猩、馬、貓、灰倉鼠、牛、豚鼠、野豬、大鼠、小鼠和雞DGKζ的氨基酸同源性分別為99.8%、98.3%、97.7%、96.6%、96.6%、96.4%、96.3%、96.0%、96.0%、94.6%和78.6%,系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)人與黑猩猩親緣關(guān)系最近,與雞的親緣關(guān)系最遠。預測的小鼠DGKζ啟動子可能結(jié)合的13個轉(zhuǎn)錄因子中ER-alpha、p53和YYY1這3個轉(zhuǎn)錄因子在黑素細胞中表達。2.Real-time PCR檢測顯示,DGKζ、PKCβⅡ在三種毛色小鼠背部皮膚中mRNA表達趨勢一致,均為:灰色組白色組;黑色組白色組,其差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);Western blotting檢測表明,顯示PKCβⅡ活性的p-PKCβⅡ/PKCβⅡ,其變化趨勢與DGKζ在三種毛色小鼠背部皮膚中表達趨勢一致:灰色組白色組;黑色組白色組,其差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);免疫組織化學ABC法染色檢測顯示,DGKζ和p-PKCβⅡ在灰色和黑色小鼠背部皮膚表皮生發(fā)層及黑素細胞、毛囊的外根鞘、毛母質(zhì)細胞及毛母質(zhì)的黑素細胞呈陽性表達,而在白色小鼠背部皮膚表皮生發(fā)層、毛囊的外根鞘、毛母質(zhì)細胞及毛母質(zhì)的黑素細胞呈陰性表達。結(jié)論:1.運用生物信息學分析預測表明,DGKζ可能在人黑素細胞中表達且在哺乳動物間保守性較高;DGKζ可能也在小鼠黑素細胞中表達。2.綜合DGKζ、PKCβⅡ在灰色與白色、黑色與白色小鼠背部皮膚中的mRNA和蛋白表達水平的差異,以及DGKζ、p-PKCβⅡ在三種毛色小鼠背部皮膚表皮生發(fā)層及黑素細胞定位、毛球毛母質(zhì)細胞及黑素細胞定位,提示DGKζ、PKCβⅡ可能與皮膚色素沉著及毛色形成具有相關(guān)性。
【學位單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：R394
【部分圖文】：

山西醫(yī)科大學碩士學位論文112結(jié)果2.1人和小鼠DGKδ的生物信息學分析2.1.1人DGKζ在各組織中的表達水平分析通過NCBI檢索分析得到DGKδ在各組織中的表達水平（圖1）。DGKζ在多種器官組織中有表達，在腦中表達量最高：24.732±10.369，在肝臟中表達量最低：0.867±0.181，在皮膚中的表達量為4.555±2.711。圖1人DGKζ在各器官組織中的表達水平2.1.2人DGKζ轉(zhuǎn)錄因子的預測通過PROMO對人DGKζ啟動子預測，得到23個可能結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的位點，轉(zhuǎn)錄因子包括：ER-alpha、C/EBPbeta、GR-alpha、Pax-5、p53、GR-beta、YY1、IRF-2、GATA-1、PRB、PRA、TCF-4E、FOXP3、c-ETS-1、AP-2alphaA、TFll-l、WT1、ETF、ENKTF-1、Sp1、RXR-alpha、STAT4、Elk-1。通過對以上轉(zhuǎn)錄因子進行文獻檢索，查閱到下列5個轉(zhuǎn)錄因子在黑素細胞中表達：ER-alpha、Sp1、p53、c-ETS-1、YY1（圖2）。

山西醫(yī)科大學碩士學位論文12圖2人DGKζ轉(zhuǎn)錄因子的預測2.1.3人DGKδ信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域的預測運用SignalP-5.0服務平臺預測人DGKδ的潛在信號肽剪切位點，結(jié)果顯示，不存在可能的信號肽裂解位點（圖3），表明人DGKδ屬于非分泌蛋白。運用TMHMM2.0Server對人DGKδ的跨膜結(jié)構(gòu)域進行預測（圖4）。由跨膜結(jié)構(gòu)域的預測分析圖可以看到，DGKδ無跨膜結(jié)構(gòu)域，因此不可能是膜上的受體或定位于膜上。圖3人DGKδ信號肽預測

山西醫(yī)科大學碩士學位論文13圖4人DGKδ跨膜結(jié)構(gòu)域預測2.1.4人DGKδ亞細胞定位的預測亞細胞定位的預測一般是通過算法進行比較檢索序列中包含的特征參數(shù)與各類相應的亞細胞定位的相似度，然后以一組概率值的形式做出判斷。通過PSORT平臺預測人DGKδ蛋白亞細胞定位，結(jié)果顯示，其分布在細胞核（nuclear）的可能性為78.30%，分布在細胞質(zhì)（cytoplasmic）的可能性為13.00%，分布于線粒體（mitochondrial）的可能性為8.70%（圖5）。圖5人DGKδ亞細胞定位78.30%13.00%8.70%細胞核（nuclear）細胞質(zhì)（cytoplasmic）線粒體（mitochondrial）
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本文編號：2870854