發(fā)布時間：2020-10-31 14:30

　　 作為細(xì)胞內(nèi)一種常見的生理活動,氧化應(yīng)激(oxidative stress)一直充當(dāng)著至為重要的角色。氧化應(yīng)激被定義為細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS)和抗氧化防御之間平衡中的干擾。隨著對于氧化應(yīng)激的認(rèn)識不斷增長,人們發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞正常活動中的發(fā)揮著重要作用。適量產(chǎn)生的ROS有利于細(xì)胞的增殖分化,免疫功能的提升,以及細(xì)胞之間的信號傳導(dǎo)等。然而,一旦這種氧化應(yīng)激平衡被打破,例如ROS的爆發(fā),將會逐漸導(dǎo)致嚴(yán)重的氧化損傷,加劇細(xì)胞凋亡甚至壞死,從而進(jìn)一步引發(fā)一系列疾病,特別是神經(jīng)退行性疾病如阿爾茲海默癥,帕金森癥等與相應(yīng)的過程密切相關(guān)。因此,關(guān)于氧化應(yīng)激相關(guān)物質(zhì)的分析檢測是研究這一過程的重要途徑,也是進(jìn)一步探究眾多生理與病理過程基礎(chǔ)之一。然而,盡管目前越來越多人致力于上述研究,也有很多具有重大意義的發(fā)現(xiàn)和突破,但這其中始終面臨著固有的挑戰(zhàn):1,細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)物質(zhì)繁多,相互之間聯(lián)系密切,對于單一物質(zhì)的檢測顯然不能滿足要求。同時,又由于它們之間的不均勻分布,混合探針難以做到相同位置的精準(zhǔn)分析;2,細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激過程主要在線粒體中進(jìn)行,因此需要進(jìn)一步開發(fā)出能夠靶向線粒體探針;3,氧化應(yīng)激相關(guān)的物質(zhì)濃度處于密切動態(tài)變化之中,實時監(jiān)測相應(yīng)變化有利于準(zhǔn)確地理解整個過程,這就意味著探針必須具有高度選擇性的,準(zhǔn)確性的檢測能力。因此,綜上所述,發(fā)展出具有能夠具有多檢測,高選擇性,準(zhǔn)確度高的單一探針對解析氧化應(yīng)激過程相關(guān)分子動態(tài)變化和機(jī)制研究具有重大意義!目前已報道多種方法用于此類物質(zhì)的檢測與分析,其中熒光法因具有高時空分辨率,廣泛應(yīng)用于細(xì)胞乃至活體內(nèi)相關(guān)物質(zhì)的成像。相比普通熒光成像技術(shù),熒光壽命成像具有更顯著的優(yōu)勢,這是由于熒光成像依賴的信號是熒光強(qiáng)度,容易受到激發(fā)光強(qiáng)度,探針濃度以及光漂白的干擾。而熒光壽命成像所展示的是熒光壽命的變化,主要取決于探針響應(yīng)前后本身性質(zhì)的改變,與激發(fā)光強(qiáng)度,樣品濃度等無關(guān),更不會受到光漂白的影響。結(jié)合欲解決的關(guān)鍵性問題和能達(dá)到的技術(shù)優(yōu)勢,本人碩士論文主要開展了以下兩個方面的工作:(1)設(shè)計并合成單分子靶向線粒體熒光探針(TFP)可用于同時檢測神經(jīng)元線粒體內(nèi)的過氧化氫(H_2O_2)和三磷酸腺苷(ATP)。該探針具有高度選擇性,高準(zhǔn)確度響應(yīng),而且其對于兩種物質(zhì)的檢測之間未發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)和交叉干擾,從而進(jìn)一步實現(xiàn)了神經(jīng)元線粒體內(nèi)H_2O_2和ATP的實時熒光壽命成像與定量分析。研究發(fā)現(xiàn)線粒體內(nèi)H_2O_2與ATP聯(lián)系密切,同時在不同時間的超氧陰離子(O_2~(·–))刺激下,線粒體內(nèi)兩者含量協(xié)同變化,而且隨著刺激時間的增加,最終導(dǎo)致不可恢復(fù)的氧化損傷,誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡。(2)構(gòu)建DNA四面體熒光納米探針用于神經(jīng)元線粒體內(nèi)pH,次氯酸(HClO),谷胱甘肽(GSH)三物質(zhì)同時檢測。通過將三個對待檢測物質(zhì)特異性響應(yīng)的分子,以及線粒體靶向分子TPP共同修飾到DNA單鏈上,最后通過雜交退火形成DNA四面體,以構(gòu)成整體的復(fù)合納米探針。同時由于DNA鏈長為12nm,因此三個熒光分子之間并不會發(fā)生FRET。另一方面,三個熒光探針的熒光壽命變化區(qū)間均能很好地區(qū)分開來,可以完成獨(dú)立的檢測。目前只完成了相關(guān)體外數(shù)據(jù)如三種探針的熒光光譜性質(zhì),檢測的準(zhǔn)確性,選擇性,以及DNA納米復(fù)合探針的合成。后續(xù)工作將主要圍繞復(fù)合探針對三種物質(zhì)的同時檢測能力,細(xì)胞毒性探究,線粒體靶向能力探究,氧化應(yīng)激狀態(tài)下神經(jīng)元成像實驗等進(jìn)行展開。
【學(xué)位單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R318;O657.3
【部分圖文】：

華東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文1第1章引言1.1活性氧與氧化應(yīng)激概述1.1.1活性氧的簡介活性氧物質(zhì)（ReactiveOxygenSpecies，ROS）是一類具有高氧化活性分子。自由基或者離子的總稱，這些物質(zhì)是由細(xì)胞新陳代謝過程中由氧分子直接或間接轉(zhuǎn)化而成。其主要包括超氧陰離子自由基（O2–），過氧化氫（H2O2），羥基自由基（OH），次氯酸（HClO），單線態(tài)氧（1O2），以及脂質(zhì)過氧化自由基（ROO）等[1-3]。圖1-1.線粒體ROS的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換[4]。線粒體是細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的主要場所，細(xì)胞內(nèi)90%以上的氧氣均在線粒體呼吸鏈中消耗,其中又約有1%~2%的氧氣被轉(zhuǎn)換為ROS[1-4]。具體而言，氧氣分子在線粒體呼吸鏈上得到所泄露的一個電子形成O2–，由于O2–的不穩(wěn)定性，很容易通過自發(fā)突變或者超氧化物歧化酶（SOD）被進(jìn)一步轉(zhuǎn)換為H2O2（O2–+e-+2H+→H2O2）。接下來，一些金屬離子如亞鐵離子（Fe2+），亞銅離子（Cu+），進(jìn)一步和H2O2發(fā)生芬頓反應(yīng)，產(chǎn)生OH（H2O2+Fe2+→OH+OH-+Fe3+;H2O2+Cu+→OH+OH-+Cu2+）。另外，還有部分H2O2會與髓過氧化物（MPO）反應(yīng)生成HClO。所產(chǎn)生的很多自由基也特別容易與被谷胱甘肽（GSH）所清除，而H2O2則容易被過氧化氫酶（Catalase）或者谷胱甘肽過氧化物酶催化轉(zhuǎn)變?yōu)樗甗1-4]。事實上，這些ROS的轉(zhuǎn)換遠(yuǎn)不止所敘述的這些，因為細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)太過于繁

華東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文3一些對ROS選擇性高，靈敏度高，準(zhǔn)確度高，響應(yīng)速度快的分析方法。本文將從常見的電化學(xué)法，表面增強(qiáng)拉曼法，化學(xué)發(fā)光法，熒光分析法進(jìn)行詳細(xì)介紹。1.1.3.1電化學(xué)檢測法電化學(xué)分析法是根據(jù)電化學(xué)原理和物質(zhì)在溶液中的電化學(xué)性質(zhì)及其變化而建立起來的一類分析方法。電化學(xué)都是將試樣溶液以適當(dāng)?shù)男问阶鳛榛瘜W(xué)電池的一部分，根據(jù)被測組分的電化學(xué)性質(zhì)，將被測定物質(zhì)的濃度轉(zhuǎn)化為一種電學(xué)參量加以測量[19,20]。這些電參量包括電極電勢、電流、電阻、電容以及電量等。由于其靈敏度高，準(zhǔn)確度高，測量方式多樣，儀器設(shè)備簡單，價格低廉等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于ROS及其相關(guān)物等的分析檢測[21-23]。此外，結(jié)合微電極，電生理等技術(shù)，電化學(xué)分析方法可以適用于活體的實時在體分析，無疑進(jìn)一步推動了整個電化學(xué)在檢測領(lǐng)域的發(fā)展，也為各類生命學(xué)研究奠定了厚實基礎(chǔ)[20-23]。Zhu[24]等人利用遠(yuǎn)距離氧化法，在1-十八烷硫醇（ODT）自組裝單分子層改性的超疏水金表面上對OH進(jìn)行了的特異性探測（圖1-2）。與鐵粉催化的芬頓反應(yīng)相比，該裝置輸出的OH速率可以通過紫外光的強(qiáng)度和/或照射時間，TiO2薄膜的表面積和/或厚度等因素來控制，這將有助于量化基底對OH的實際響應(yīng)量。同時，這也是首次通過電化學(xué)阻抗法在光催化體系中建立了一種高效靈敏的OH檢測方法，并成功地應(yīng)用于內(nèi)霉素（LPS）介導(dǎo)的細(xì)胞ROS/RNS爆發(fā)過程中OH的檢測。該研究不僅為測定與生理和病理過程密切相關(guān)的活細(xì)胞產(chǎn)生的OH和其他ROS提供了方法學(xué)依據(jù)，而且為電化學(xué)阻抗光譜法檢測生物小分子開辟了新的途徑。圖1-2.ODT自組裝單分子層改性的超疏水金表面上對OH檢測裝置示意圖[24]。

華東師范大學(xué)碩士學(xué)位論文4此外，該課題組還首次利用氨基三乙酸/組氨酸標(biāo)簽物能夠促進(jìn)SOD的電子傳遞的特點(diǎn)，進(jìn)一步將相應(yīng)物質(zhì)固定在碳電極表面，開發(fā)了對O2–檢測具有高選擇性和靈敏度，低檢測限，寬檢測區(qū)間和良好的重現(xiàn)性等優(yōu)點(diǎn)的生物傳感器，并成功地監(jiān)測了大鼠腦缺血與再灌注過程中腦內(nèi)O2–動態(tài)變化[25]。此研究為基于氨基三乙酸穩(wěn)定微電極的ROS體內(nèi)監(jiān)測提供了一種新的方法，由此可以獲得更多的關(guān)于氧化應(yīng)激和其他生理和病理解析。Hu[26]等人首次利用鍍碳納米電極作為掃描電化學(xué)顯微鏡的尖端穿透活細(xì)胞，實時獨(dú)立測量局部四種ROS/RNS（H2O2，ONOO–，NO2-，NO）的濃度和變化。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞與正常乳腺上皮細(xì)胞相比展示了大量的ROS與RNS，并且正常細(xì)胞在DAG-lactone作用下激活蛋白激酶C（PKC）會引起ROS/RNS的爆發(fā)，揭示了PKC與氧化應(yīng)激之間的聯(lián)系。此外，該探針還可以檢測囊泡等其它亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)的ROS/RNS，不僅可以作為一種合適的分析平臺，還可以充分早充當(dāng)期腫瘤的診斷工具。1.1.3.2表面增強(qiáng)拉曼法（surfaceenhancedramanscattering,SERS）SERS依賴于分子吸附到某些粗糙的金屬表面如金，銀，銅等產(chǎn)生明顯增強(qiáng)的拉曼散射，增強(qiáng)因子通常有104~106，由此可以對極低濃度的物質(zhì)進(jìn)行檢測[27,28]。目前表面增強(qiáng)拉曼主要的增強(qiáng)機(jī)理有兩種，物理增強(qiáng)和化學(xué)增強(qiáng)，基于此人們也研究開發(fā)出了一系列具有高增強(qiáng)因子的基底材料用于ROS的檢測。圖1-3.雙仿生功能SERS基底材料用于H2O2檢測示意圖[29]。Yu[29]等人報告了一種簡便，經(jīng)濟(jì)，環(huán)保的方法，制備出一種新型的雙仿生功能（超疏水和過氧化氫酶樣活性）SERS基底材料（圖1-3）。事實上，他們利
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本文編號：2864071