發(fā)布時間：2020-10-28 02:47

　　 擬南芥FRS(FAR1-related sequences)蛋白家族包含F(xiàn)HY3和FAR1以及FRS1至FRS12共14個家族成員。FRS蛋白家族的序列具有高度同源性以及含有保守的二級結(jié)構(gòu)域,其家族成員具有核定位信號和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域,并且在蓮座葉、莖生葉、花序莖和花等組織中表達,參與調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。前人研究發(fā)現(xiàn),擬南芥FRS6和FRS8可能負調(diào)控開花時間,但是下游靶基因和潛在的分子機制尚不清楚。本研究通過觀察FRS6和FRS8的突變體(frs6、frs8、frs6 frs8)和FRS6過表達株系(FRS6-OE-L1、FRS6-OE-L3)的表型,未發(fā)現(xiàn)如文章報道明顯開花表型,但是發(fā)現(xiàn)frs6、frs8和frs6 frs8具有短下胚軸表型,FRS6-OE-L1和FRS6-OE-L3具有長下胚軸表型,在此基礎(chǔ)上利用分子生物學和生物化學等方法探究FRS6和FRS8在下胚軸伸長過程中的作用機制,主要結(jié)果如下:亞細胞定位發(fā)現(xiàn)FRS6和FRS8定位細胞核;GUS染色發(fā)現(xiàn)在擬南芥幼苗時期FRS6和FRS8主要在根、子葉葉脈和尖端以及下胚軸中表達,在成苗時期主要在莖、葉片尖端、花及葉柄中表達。表型觀察發(fā)現(xiàn),無論長日照還是短日照,與野生型Col-0相比,frs6、frs8和frs6 frs8下胚軸短,而FRS6-OE-L1和FRS6-OE-L3下胚軸長。經(jīng)不同光質(zhì)處理發(fā)現(xiàn),紅光處理較白光處理表型差異更明顯,而遠紅光與藍光處理,下胚軸長度無明顯差異,表明FRS6和FRS8通過響應紅光信號轉(zhuǎn)導途徑正調(diào)控擬南芥下胚軸伸長過程。酵母雙雜交實驗發(fā)現(xiàn)FRS6與FRS8能夠形成同源或異源二聚體,但不與紅光受體phyB相互作用;酵母篩庫發(fā)現(xiàn)HISTONE DEACETYLASE 15(HDA15)與FRS6和FRS8相互作用,并通過酵母雙雜交實驗驗證。前人研究表明,紅光條件下,HDA15是下胚軸伸長的負調(diào)控因子,因此HDA15與FRS6和FRS8可能在響應紅光信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)控擬南芥下胚軸伸長過程中起相互拮抗作用。施加生長素(IAA)和生長素抑制劑(NPA)后,與野生型Col-0相比,frs6、frs8、frs6 frs8和FRS6-OE-L1和FRS6-OE-L3下胚軸長度變化量無明顯差異;施加GA后FRS6-OE-L1和FRS6-OE-L3下胚軸有明顯伸長,施加PAC后其下胚軸伸長受到明顯抑制。赤霉素合成相關(guān)基因在FRS6-OE--L1和FRS6-OE--L3中表達上調(diào),在frs6中表達下調(diào)。酵母單雜交實驗證實FRS6和FRS8能夠結(jié)合赤霉素合成基因GA20OX4啟動子,表明FRS6和FRS8可能通過調(diào)節(jié)赤霉素合成基因的表達調(diào)控下胚軸伸長。綜上所述,擬南芥FRS6和FRS8在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。FRS6和FRS8定位于細胞核,兩者相互作用,與HDA15結(jié)合,紅光下相互拮抗調(diào)節(jié)植物下胚軸伸長。同時,FRS6和FRS8結(jié)合GA20OX4啟動子參與赤霉素合成,調(diào)控下胚軸伸長。對FRS6和FRS8的研究,有利于理解下胚軸伸長的調(diào)節(jié)機制,同時為FRS蛋白家族其它成員的功能探究提供新的思路。
【學位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文51前言1.1FRS蛋白家族1.1.1FRS蛋白家族概述FRS（FAR1-relatedsequences）蛋白家族由FAR-REDELONGATEDHYPOCOTYLS3（FHY3）和FAR-REDIMPAIREDRESPONSE1（FAR1），以及FRS1至FRS12共14個成員組成（Initiative,2000）。根據(jù)多序列比對和保守的蛋白基序分析將擬南芥FRS蛋白家族分為五個亞組，分別為組1（FHY3、FAR1、FRS1、FRS2和FRS4），組2（FRS6和FRS8），組3（FRS7和FRS12），組4（FRS3、FRS5和FRS9），組5（FRS10和FRS11）（圖1-1）。序列同源性和家庭成員之間保守的二級結(jié)構(gòu)表明，這組蛋白可能參與響應生物與非生物脅迫的信號轉(zhuǎn)導過程。在其他物種如單子葉植物中鑒定出FRS同源蛋白，表明該蛋白家族在植物界的整個進化過程中是保守的。推測FRS蛋白家族在植物生長和發(fā)育過程中扮演著重要角色（Hudsonetal.,1999;WangandDeng,2002）。圖1-1擬南芥FRS家族進化樹（LinandWang,2004）Fig.1-1ThephylogenetictreeofFRSfamilyinArabidopsisthaliana（LinandWang,2004）1.1.2FRS蛋白家族結(jié)構(gòu)和DNA結(jié)合活性分析FRS家族的大多數(shù)成員均有N末端C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域（也稱為FAR1DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域），以及C末端SWIM（SWI2/SNF2和MuDR轉(zhuǎn)座酶）鋅指結(jié)構(gòu)域。另外，C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域是一種類似于MULE轉(zhuǎn)座酶的中央轉(zhuǎn)座酶結(jié)構(gòu)域（LinandWang,2004;Linetal.,2007）（圖1-2）。家族成員FHY3的N端或C端結(jié)構(gòu)域的異位過表達會導致擬南芥幼苗出現(xiàn)長下胚軸表型，當FHY3只有C端過表達時，則表現(xiàn)在遠紅光下完全黃化的表型。表明FHY3的C末端片段的過表達會損害FHY3內(nèi)源性的功能（WangandDeng,

擬南芥FRS6和FRS8調(diào)控下胚軸伸長的分子機制62002）。另外，F(xiàn)HY3的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于N端，可直接與FAR-REDELONGATEDHYPOCOTYLS1（FHY1）和FHY1-LIKE（FHL）啟動子結(jié)合并促進其基因表達，從而間接影響phyA向核內(nèi)的轉(zhuǎn)運（Linetal.,2007），表明這兩個結(jié)構(gòu)域?qū)τ贔RS家族蛋白功能以及轉(zhuǎn)錄活性至關(guān)重要。圖1-2FRS家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域（MaandLi,2018）Fig.1-2ConservedproteindomainofFRSfamilyproteins（MaandLi,2018）具有代表性的FRS家族蛋白FHY3和FAR1與FHY3/FAR1結(jié)合位點（FBS,CACGCGC）順式元件結(jié)合，這些順式元件位于包括FHY1、FHL、EARLY-FLOWERING4（ELF4）、ACCUMULATIONANDREPLICATIONOFCHLOROPLASTS5（ARC5）、CONSTITUTIVEPHOTOMORPHOGENIC1（COP1）等在內(nèi)的靶基因的啟動子區(qū)域（Linetal.,2007;Lietal.,2011a;Ouyangetal.,2011;Huangetal.,2012;Gaoetal.,2013），F(xiàn)RS4/CPD25也可以與ARC5啟動子中的FBS或FBS-like（FBL）順式元件結(jié)合（Gaoetal.,2013）。家族中的FRS12可以特異性識別PHYTOCHROMEINTERACTINGFACTOR4（PIF4），GIGANTEA（GI）和PHYTOCHROMEINTERACTINGFACTOR3-LIKE1（PIL1）啟動子中的FRS12-BOX修飾位點（FRB1,TGTGTG;FRB2,TATATATATATATATATAT,FRB3,TATACATA）（Ritteretal.,2017）。1.1.3FRS蛋白家族的定位及表達分析大多數(shù)FRS蛋白包含一個或兩個具有四個氨基酸殘基的核定位信號序列（NLSs）。這些NLSs位于某些FRS蛋白（FRS2、FRS7和FRS12）C端或在其他FRS蛋白（FRS3、FRS4、FRS5、FRS10和FRS11）N端，但FRS8既不具有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域也不具有NLSs，

山東農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文11是調(diào)節(jié)響應R的主要光敏色素。在光照條件下，這些光敏色素可抑制光信號的兩個主要分支：COP1-TFs和PIFs。COP1是一種E3泛素連接酶，光照條件下會受到phyB的抑制，COP1靶向幾種促進光形態(tài)發(fā)生的轉(zhuǎn)錄因子如HY5、HY5HOMOLOG（HYH）、LONGAFTERFAR–REDLIGHT1（LAF1）和LONGHYPOCOTYLINFAR–RED1（HFR1）的降解，PIFs可被COP1靶向降解，并且PIFs通過促進COP1/phyB相互作用進而促使phyB降解（圖1-3）。圖1-3植物色素信號傳導途徑的簡化模型（Lietal.,2011b）Fig.1-3Asimplifiedmodelofthephytochromesignalingpathway（Lietal.,2011b）1.2.1.1phyA介導遠紅光對下胚軸的調(diào)控phyA是介導植物對遠紅光（FR）各種響應的主要感光受體，抑制擬南芥下胚軸伸長，促進頂端彎鉤的出現(xiàn)，使子葉打開，促進花青素的積累（Nagatanietal.,1993;Whitelametal.,1993）。遠紅光下phyA通過穿梭蛋白FHY1和FHL從細胞質(zhì)進入到細胞核（SheerinandHiltbrunner,2017）。分子遺傳學研究加深了我們對phyA信號傳導的理解，特別是關(guān)于phyA與光響應基因以及與光形態(tài)建成相關(guān)基因，這些包括PHYTOCHROMEINTERACTINGFACTOR3（PIF3）、POLYKETIDESYNTHHASE1（PKS1）、（NUCLEOSIDEDIPHOSPHATEKINASE2）NDPK2，隱色色素CRYPTOCHROME1（CRY1）和CRYPTOCHROME2（CRY2）和AUX/IAA蛋白（Colón-Carmonaetal.,2000;Quail,2000）。研究表明，遠紅光下phyA抑制下胚軸伸長，F(xiàn)HY3和FAR1被確定為擬南芥中phyA介導的遠紅光信號轉(zhuǎn)導關(guān)鍵成分，在phyA介導的遠紅光信號通路中FHY3和FAR1抑制下胚軸的伸長（WangandDeng,2002）。
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本文編號：2859459