根據(jù)市場調(diào)查顯示,豬肉是市民需求量最多的肉制食物。豬圓環(huán)病毒(Porcine Circovirus Type,PCV)中的豬圓環(huán)病毒2型(Porcine Circovirus Type 2,PCV2)是影響豬生長發(fā)育及繁殖的困擾因素之一。豬圓環(huán)病毒2型是引起是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)的主要病原,從而給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此,有必要開發(fā)出一種定性、定量快速檢測豬的PCV2的方法。本實(shí)驗(yàn)室已建立PCV2熒光定量PCR快速定性、定量檢測技術(shù),并且用該技術(shù)研制出試劑盒,命名為豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)熒光定量PCR快速檢測試劑盒,目前處于藥證申報(bào)階段。本實(shí)驗(yàn)采用熒光定量PCR技術(shù)來定性和定量檢測PCV2,通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量檢測病毒含量�？赏ㄟ^此方法判斷感染豬患PCV2的程度,進(jìn)行檢測、隔離和淘汰豬仔。本論文主要針對該試劑盒的原材料、生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系進(jìn)行研究。主要內(nèi)容及結(jié)果如下:在試劑盒原材料研究中,對原材料進(jìn)行比對和優(yōu)選,分別對三家公司生產(chǎn)的Taq酶、PCR反應(yīng)緩沖液和UDG酶進(jìn)行比對試驗(yàn)。在qPCR擴(kuò)增結(jié)果中Takara寶生物工程(上海)有限公司的Taq酶和PCR反應(yīng)緩沖液的Ct值和熒光增長值最高,擴(kuò)增效率最好;上海博彩生物科技公司的UDG酶能有效去除污染,且質(zhì)優(yōu)價(jià)廉;同時(shí)為試劑盒制備了參考品,其陽性參考品的Ct值在20-25、最低檢測限參考品的Ct值在30-35、精密性參考品的Ct值在20-25、陰性參考品無擴(kuò)增曲線和Ct值。在試劑盒的生產(chǎn)工藝研究中,對影響生產(chǎn)工藝的因素溫度進(jìn)行了研究,即高濃度樣本、中濃度樣本和低濃度樣本分別在凍融次數(shù)、2-8℃、-20℃、-70℃和低溫運(yùn)輸時(shí)的最適保存期限進(jìn)行了研究。其中被測中濃度樣本于-20℃儲存條件下反復(fù)凍融其核酸濃度會降低,凍融次數(shù)超過5次后熒光增長值會從4.13減弱到1以下,所以建議凍融次數(shù)一般不超過5次。同樣原理,不同濃度樣本在室溫下模擬冰袋低溫運(yùn)輸0小時(shí)(hour,h)、24 h、48、72 h、96 h和120 h后,其核酸濃度會降低,在運(yùn)輸72 h之前的樣本的Ct值的CV值都小于5%,而低濃度樣本在運(yùn)輸96 h時(shí)的Ct值明顯滯后,CV值大于5%。因此綜合考慮樣品在冰袋低溫運(yùn)輸不宜超過96 h。不同濃度的樣本在2-8℃的存儲0天、1天、2天、3天、4天和5天時(shí)分別進(jìn)行核酸提取和qPCR擴(kuò)增檢測,高濃度樣本的變異系數(shù)都小于5%,中濃度樣本在儲存第5天時(shí),其變異系數(shù)大于5%,低濃度樣本第4天時(shí)Ct值的變異系數(shù)大于5%,因此將3天作為2-8℃存儲條件下的樣本有效期。不同濃度樣本在-20℃存儲0天、1個(gè)月、2個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月、8個(gè)月、10個(gè)月、12個(gè)月時(shí)分別進(jìn)行核酸提取和qPCR擴(kuò)增檢測,同理將6個(gè)月作為-20℃的保存期限。不同濃度樣本在-70℃存儲0天、1個(gè)月、2個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月、8個(gè)月、10個(gè)月、12個(gè)月時(shí)分別進(jìn)行核酸提取和qPCR擴(kuò)增檢測,同理將12個(gè)月作為-70℃的保存期限。在試劑盒總反應(yīng)體系分別為12.5μL,25μL和50μL的相關(guān)用量試驗(yàn)中,25μL體系和50μL體系結(jié)果顯示樣本均獲得較高的熒光信號值,12.5μL的反應(yīng)體系中靈敏度不高且熒光增長值較低,50μL體系靈敏度高易造成假陽性且耗費(fèi)試劑多一倍。因此將25μL作為總反應(yīng)體系。
【學(xué)位單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：S852.651
【部分圖文】：

上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文第一章緒論1第1章緒論1.1豬圓環(huán)病毒簡介1.1.1豬圓環(huán)病毒基因組和分子生物學(xué)結(jié)構(gòu)豬圓環(huán)病毒（PCV），屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，由德國人Tischer于1974年首次在豬腎細(xì)胞系(PigKidney－15Cells，PK－15)中發(fā)現(xiàn)，1982年確定該病毒大小是17－22nm的環(huán)狀DNA病毒，并被命名為豬圓環(huán)病毒，是迄今為止動物病毒中最小的DNA病毒[1]。PCV病毒呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，無囊膜，由衣殼蛋白和基因組組成。基因組是一條共價(jià)單股環(huán)狀DNA病毒，全長1766－1768bp。根據(jù)病毒的基因組成和抗原性的不同，病毒主要分為豬圓環(huán)病毒1(Porcinecircovirustype1,PCV1)和豬圓環(huán)病毒2型(Porcinecircovirustype2,PCV2)。通常認(rèn)為，PCV1不具有致病性，不引起細(xì)胞病變，可以制成弱毒疫苗。PCV2具有較強(qiáng)的致病性。PCV2是引起豬圓環(huán)病毒�。≒orcinecircovirusassociateddisease,PCVAD）的主要病原體。自1998年發(fā)現(xiàn)PCV2以來，這種小的、無包膜的環(huán)狀DNA病毒被認(rèn)為是全球豬群中最重要的病原體之一，其基因大小只有約皰疹病毒的1％。圖1-1參考PMWS(AF027217)基因組序列繪制的PCV2基因組結(jié)構(gòu)圖（代振江等，2016）Fig1-1.ThemapofPCV2genomicstructure

要的意義[51-55]。如張福良等以定量的10倍系列稀釋質(zhì)粒pMD-ORF2（含PCV2ORF2全基因）為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[56]。建立了豬圓環(huán)病毒2型的熒光定量PCR檢測方法。該方法檢測靈敏度可達(dá)1.0×1010拷貝/μL，線性范圍為109-1010，達(dá)10個(gè)數(shù)量級。該方法的檢測靈敏度與套式PCR相當(dāng)，甚而高于常規(guī)PCR，該方法具有較好的特異性和重復(fù)性。由于PCR技術(shù)的敏感度都較高，而只有PCV2病毒含量達(dá)到一定程度，豬才表現(xiàn)出PMWS癥狀與病變[57]。因此，該方法實(shí)施定量測定，為PMWS的預(yù)警與診斷起很大作用[58]。圖1-2Taqman熒光探針法原理Fig1-2PrincipleofTaqManfluorescentprobemethod

上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文第三章試劑盒主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究293.3結(jié)果與分析3.3.1樣本凍融次數(shù)中濃度樣本在-20℃條件下反復(fù)凍融1次，3次，5次，7次，9次后，進(jìn)行核酸提取和qPCR擴(kuò)增檢測，檢測如圖3-1所示，熒光增長值會隨著凍融次數(shù)的增多而下降，在凍融超過5次后，熒光增長值會大大降低。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，凍融次數(shù)超過5次后對于檢測的熒光增長值會減弱到1以下。因此綜合考慮建議樣本的凍融次數(shù)一般不超過5次。圖3-1凍融次數(shù)試驗(yàn)Fig3-1Numbersoffreeze-thawtests3.3.2樣本在2-8℃儲存時(shí)間的試驗(yàn)不同濃度的樣本在2-8℃的存儲條件下，在存儲0天、1天、2天、3天、4天和5天時(shí)分別對不同濃度的樣本進(jìn)行核酸提取和qPCR擴(kuò)增檢測，其平均Ct值變化如表3-4。表3-4不同濃度樣本在2-8℃儲存時(shí)間的Ct值Table3-4Ctvaluesofsamplesofdifferentconcentrationsstoredat2-8℃樣本濃度Ct值0天1天2天3天4天5天
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本文編號：2858880