雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)是一種單細胞綠藻,在脅迫條件下能夠大量積累蝦青素,具有較高的經(jīng)濟價值。蝦青素具有顯著的著色能力,并能夠抗癌變、抗氧化、抗紫外線輻射及增強免疫力等,在保健品、化妝品、醫(yī)藥、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。在規(guī)�；囵B(yǎng)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的過程中,優(yōu)良藻株的誘變選育一直是研究的重點和熱點。誘變選育出生長速度快、蝦青素含量高的藻株在工業(yè)生產(chǎn)中具有較強的實用意義。為了提高雨生紅球藻的生物量和蝦青素含量,本研究采用了紫外線誘變的方法。以雨生紅球藻株(H0)為出發(fā)藻株,根據(jù)致死率,確定了紫外照射的最適時間為8min。經(jīng)過誘變、篩選和對藻株性能的檢測,獲得了兩株生物量和蝦青素含量都較高的突變藻株H7和H11。與出發(fā)藻株比,突變株的生長速度提高了18.9%和17.0%,蝦青素含量提高了9.0%和4.5%。在選育了優(yōu)良藻株的基礎(chǔ)上,本論文對雨生紅球藻培養(yǎng)基中氮源的種類、最適濃度,以及磷源的最適濃度進行了研究。通過比較硝酸鈉、碳酸氫銨和氯化銨對雨生紅球藻生長的影響,發(fā)現(xiàn)雨生紅球藻的適宜氮源為硝酸鈉,適宜的濃度為1.0g/L。雨生紅球藻在含1.0g/L硝酸鈉的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)12天,生物量可以達到4.85×105cell/ml,培養(yǎng)結(jié)束后,蝦青素可以有效積累,含量達到3.49%。磷的最適濃度為0.04g/L,在最適磷濃度下,連續(xù)培養(yǎng)12天,生物量可以達到5.9×105cell/ml,誘變15天后,蝦青素含量達到3.82%。最后通過正交實驗得到,NaNO3濃度、K2HPO4·3H2O濃度、pH分別為0.8g/L、.04g/L、7的配方利于雨生紅球藻的生長,NaNO3濃度、K2HPO4·3H2O濃度、初始pH分別為0.4g/L0.06g/L、6的配方利于雨生紅球藻蝦青素的積累。最后,在分子水平上對雨生紅球藻氮代謝中的關(guān)鍵酶-硝酸還原酶進行了研究。首次克隆了雨生紅球藻硝酸還原酶基因DNA及cDNA序列。硝酸還原酶基因序列的全長為5636bp,含15段外顯子和14段內(nèi)含子,cDNA序列的全長為共2718bp,共編碼905個氨基酸,對雨生紅球藻的硝酸還原酶氨基酸序列進行BlastP比對分析,發(fā)現(xiàn)有三個較為保守的結(jié)構(gòu)域分別為Mo-Co復(fù)合體結(jié)合域、亞鐵血紅素結(jié)合域和FAD結(jié)合域。采用實時熒光定量PCR的方法對硝酸還原酶基因的轉(zhuǎn)錄水平進行分析,發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中硝酸鈉的濃度為0-1.0g/L時,隨著硝酸鹽濃度的增高,雨生紅球藻硝酸還原酶的表達量增加。這可能是由于硝酸還原酶是硝酸鹽同化的關(guān)鍵酶,培養(yǎng)基中硝酸鹽濃度增高,需要的硝酸還原酶增多,所以其表達量就會增加,進而使得雨生紅球藻的生長速度加快。綜上所述,本研究采用紫外誘變的方法,誘變篩選了生長速度較快且蝦青素含量較高的藻株,初步確定了其適宜的氮源和磷源濃度,為工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。通過克隆硝酸還原酶基因并分析其在不同氮濃度下的轉(zhuǎn)錄水平,為研究雨生紅球藻的氮代謝過程及指導(dǎo)氮源優(yōu)化提供了分子基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：Q949.2
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1. 蝦青素的結(jié)構(gòu)、功能及來源
        1.1 蝦青素的化學(xué)結(jié)構(gòu)
        1.2 蝦青素的功能
        1.3 蝦青素的來源
    2. 雨生紅球藻的生物學(xué)特性
    3. 雨生紅球藻中蝦青素的積累機制
    4. 影響雨生紅球藻生長及蝦青素積累的主要因素
        4.1 光照對雨生紅球藻生長及蝦青素積累的影響
        4.2 溫度對雨生紅球藻生長及蝦青素積累的影響
        4.3 pH對雨生紅球藻生長及蝦青素積累的影響
        4.4 營養(yǎng)鹽對雨生紅球藻生長及蝦青素積累的影響
    5. 微藻育種的方法
        5.1 自然選擇育種
        5.2 誘變育種
        5.3 生物學(xué)方法育種
        5.4 雨生紅球藻誘變育種的研究進展
    6. 硝酸還原酶研究進展
    7. 論文的立項依據(jù)和研究目的
第二章 雨生紅球藻的誘變選育
    1 材料與方法
        1.1 藻種來源
        1.2 培養(yǎng)基各營養(yǎng)成分及其制備
        1.3 培養(yǎng)條件
        1.4 實驗方法
    2 實驗結(jié)果
        2.1 雨生紅球藻培養(yǎng)液吸光度-細胞密度關(guān)系的確定
        2.2 蝦青素含量測定時超聲破碎時間的確定
        2.3 誘變時間的確定
        2.4 突變株的篩選
        2.5 突變株的性狀測定
    3 討論
第三章 雨生紅球藻培養(yǎng)基氮源和磷源的優(yōu)化
    1. 材料與方法
        1.1 藻種
        1.2 培養(yǎng)基
        1.3 培養(yǎng)條件
        1.4 實驗方法
    2. 實驗結(jié)果
        2.1 硝酸鈉對雨生紅球藻生長和色素積累的影響
        2.2 碳酸氫銨對雨生紅球藻生長和色素積累的影響
        2.3 氯化銨對雨生紅球藻生長和色素積累的影響
        2.4 不同磷濃度對藻株的影響
        2.5 正交實驗結(jié)果
    3. 討論
第四章 藻株硝酸還原酶基因的克隆及其轉(zhuǎn)錄分析
    1. 材料與方法
        1.1 藻種
        1.2 培養(yǎng)基
        1.3 培養(yǎng)條件
        1.4 實驗方法
    2. 結(jié)果分析
        2.1 雨生紅球藻基因組DNA的提取
        2.2 硝酸還原酶基因的克隆
        2.3 測序結(jié)果及序列分析
        2.4 硝酸還原酶表達量分析
    3. 討論
全文總結(jié)
參考文獻
致謝
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本文編號：2846966