發(fā)布時(shí)間：2020-10-17 18:33

　　 多殺性巴氏桿菌是能引起多種動(dòng)物致病的革蘭氏陰性菌。現(xiàn)有研究表明,以全局調(diào)控基因crp或phoP為靶基因在大腸桿菌或沙門(mén)氏菌進(jìn)行疫苗開(kāi)發(fā)研究卓有成效。然而,在多殺性巴氏桿菌中對(duì)這兩個(gè)基因的相關(guān)研究還相當(dāng)匱乏,基于此,我們的研究結(jié)果如下：1、潛在基因的篩選鑒定：將潛在的多殺性巴氏桿菌crp、phoPi：含兩段潛在序列,分別命名為phoP1和phoP2)基因分別克隆至低拷貝質(zhì)粒pYA3332后引入沙門(mén)氏菌相應(yīng)突變株,利用麥康凱顯色試驗(yàn)成功鑒定多殺性巴氏桿菌crp基因,利用X-P平板顯色試驗(yàn)和多粘菌素B抗性試驗(yàn)確定phoP2基因?yàn)檎嬲亩鄽⑿园褪蠗U菌phoP基因。同時(shí),制備了Crp和PhoP的兔源多克隆抗體；2、突變株構(gòu)建：通過(guò)自殺質(zhì)粒pYA4278介導(dǎo)的同源重組方法,成功地構(gòu)建的禽源多殺性巴氏桿菌Pasteurella multocida DY120818株crp、phoP基因缺失株。兩基因缺失株均遺傳穩(wěn)定性良好。根據(jù)后續(xù)試驗(yàn)需要,基于大腸桿菌-巴氏桿菌科穿梭質(zhì)粒pMC-express,成功地構(gòu)建P. multocida DY120818 crp基因缺失株的互補(bǔ)株；3、生物學(xué)功能鑒定：多殺性巴氏桿菌缺失crp基因后,菌株的生長(zhǎng)速度明顯減緩,對(duì)部分碳源和氨基酸代謝能力改變；表型特征(外膜蛋白和脂多糖圖譜)無(wú)明顯變化,對(duì)鴨血清的敏感性顯著升高,在雛鴨模型中通過(guò)口服途徑和滴鼻途徑攻毒,毒力分別較野生株降低了22倍和86倍；多殺性巴氏桿菌缺失phoP基因后,菌株的生長(zhǎng)速度、代謝能力、表現(xiàn)特征和血清敏感性均無(wú)明顯變化,在雛鴨模型中測(cè)定力通過(guò)口服途徑和滴鼻途徑攻毒,毒力分別較野生株降低了32倍和154倍；4、免疫保護(hù)力測(cè)定：雛鴨經(jīng)滴鼻免疫P. multocida DY120818 △crp株活菌,或經(jīng)口服免疫P. multocida DY120818 △phoP株活菌,用野生株攻毒,分別能達(dá)到60%和54.5%的保護(hù)效力。然后,采用P. multocida DY120818野生型滅活全菌菌體或外膜蛋白分別檢測(cè)免疫后雛鴨血清IgY和膽汁IgA水平,均能檢測(cè)到較強(qiáng)的體液免疫和粘膜免疫應(yīng)答水平；5、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析：在相同培養(yǎng)條件下,對(duì)禽多殺性巴氏桿菌P. multocida DY120818野生型,crp和phoP基因缺失株分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,以野生型數(shù)據(jù)為對(duì)照,分別在phoP基因缺失株中得到186個(gè)、334個(gè)差異表達(dá)基因；通過(guò)對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行包括GO功能注釋、KEGG通路在內(nèi)的生物信息學(xué)分析,對(duì)多殺性巴氏桿菌轉(zhuǎn)錄因子phoP基因的調(diào)控功能得到初步了解�？傊�,在本研究中,我們首次在多殺性巴氏桿菌中對(duì)全局調(diào)控基因、phoP基因進(jìn)行了功能鑒定,并在強(qiáng)毒株P(guān). multocida DY120818中分別構(gòu)建了crp和phoP基因突變株,鑒定了這兩個(gè)基因?qū)?xì)菌生長(zhǎng)、生化代謝、LPS和OMPs圖譜結(jié)構(gòu),血清敏感性和毒力等生物學(xué)功能方面的影響；測(cè)定了以上兩個(gè)基因缺失株以活菌疫苗疫苗的形式免疫雛鴨后的免疫保護(hù)效應(yīng)；更進(jìn)一步地,依靠轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),對(duì)基因突變株中差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,為進(jìn)一步了解多殺性巴氏桿菌中crp、phoP的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S852.61
【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮寫(xiě)詞表
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    一 多殺性巴氏桿菌綜述
        1 多殺性巴氏桿菌的生物學(xué)特性
            1.1 形態(tài)特征
            1.2 生長(zhǎng)要求和培養(yǎng)條件
            1.3 生化特性
            1.4 實(shí)驗(yàn)室診斷
        2 多殺性巴氏桿菌流行病學(xué)特征
        3 多殺性巴氏桿菌的毒力因子
    二 crp、phoP基因?qū)?xì)菌毒力的影響及其在巴氏桿菌中的研究進(jìn)展
        1 crp基因?qū)?xì)菌毒力的影響及其在P.multocida中的研究進(jìn)展
        2 phoP基因?qū)?xì)菌毒力的影響及其在P.multocida中的研究進(jìn)展
    三 研究目的及意義
第二部分 試驗(yàn)研究
    四 多殺性巴氏桿菌潛在crp、phoP基因的鑒定、克隆表達(dá)及其多克隆抗體的制備
        1 材料
            1.1 菌株和質(zhì)粒
            1.2 引物
            1.3 主要試劑
            1.4 主要儀器
            1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2 試驗(yàn)方法
            2.1 多殺性巴氏桿菌潛在crp、phoP基因的篩選
            2.2 多殺性巴氏桿菌潛在crp、phoP基因的功能鑒定
            2.3 多殺性巴氏桿菌crp、phoP基因的克隆表達(dá)及其多克隆抗體的制備
        3 試驗(yàn)結(jié)果
            3.1 多殺性巴氏桿菌潛在crp、phoP基因的克隆
            3.2 異源功能互補(bǔ)鑒定多殺性巴氏桿菌crp、phoP基因
            3.3 多殺性巴氏桿菌crp、phoP基因的克隆表達(dá)與純化
        4 討論
        5 結(jié)論
    五多殺性巴氏桿菌crp、phop基因缺失株及其互補(bǔ)株的構(gòu)建
        1 材料
            1.1 菌株和質(zhì)粒
            1.2 引物
            1.3 主要試劑
            1.4 主要儀器
        2 試驗(yàn)方法
            2.1 自殺質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2 crp、phop基因缺失株的篩選和鑒定
            2.3 crp基因缺失株的互補(bǔ)株的構(gòu)建
        3 試驗(yàn)結(jié)果
            3.1 重組自殺質(zhì)粒的構(gòu)建
            3.2 突變株的構(gòu)建與篩選
            3.3 基因缺失株的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)
            3.4 crp基因缺失株互補(bǔ)株的構(gòu)建
        4 討論
        5 結(jié)論
    六多殺性巴氏桿菌crp、phoP基因生物學(xué)功能鑒定
        1 材料
            1.1 菌株
            1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.3 主要試劑
            1.4 主要儀器
        2 試驗(yàn)方法
            2.1 生長(zhǎng)特性
            2.2 生化鑒定
            2.3 表型鑒定
            2.4 血清敏感性試驗(yàn)
            2.5 毒力測(cè)定
        3 試驗(yàn)結(jié)果
            3.1 生長(zhǎng)曲線
            3.2 生化鑒定
            3.3 表型鑒定
            3.4 清敏感試驗(yàn)
            3.5 毒力試驗(yàn)
        4 討論
        5 結(jié)論
    七基因缺失株在雛鴨體內(nèi)的免疫保護(hù)水平檢測(cè)
        1 材料
            1.1 菌株
            1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.3 主要試劑
            1.4 主要儀器
        2 試驗(yàn)方法
            2.1 雛鴨的免疫
            2.2 抗體水平檢測(cè)
        3 試驗(yàn)結(jié)果
            3.1 保護(hù)力測(cè)定
            3.2 抗體水平測(cè)定
        4 討論
        5 結(jié)論
    八 crp、phoP基因缺失株差異表達(dá)基因分析
        1 材料
            1.1 菌株
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器
        2 試驗(yàn)方法
            2.1 菌體樣品的準(zhǔn)備
            2.2 測(cè)序試驗(yàn)流程
            2.3 信息分析流程
        3 試驗(yàn)結(jié)果
            3.1 測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)控、剪切與統(tǒng)計(jì)
            3.2 全基因GO功能注
            3.3 全基因組KEGG通路注釋
            3.4 基因的差異表達(dá)分析
            3.5 差異基因的GO注釋
            3.6 差異基因的GO功能富集分析
            3.7 差異基因的KEGG通路顯著性富集分析
        4 討論
            4.1 關(guān)于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
            4.2 關(guān)于多殺性巴氏桿菌Crp、PhoP轉(zhuǎn)錄調(diào)控子
        5 小結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介
攻讀碩士學(xué)位期間完成的學(xué)術(shù)論文
附錄

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