【摘要】：裂殖壺菌(A urantiochytrium limacinum)又稱裂壺藻,是一種海洋真菌,細(xì)胞內(nèi)含有大量的油脂,其中二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid,簡稱DHA)含量最多。DHA是一種是重要的n-3多不飽和脂肪酸,能促進(jìn)嬰幼兒大腦和視網(wǎng)膜的發(fā)育及成熟,并且對(duì)老年人降低血脂、預(yù)防心血管疾病等有明顯作用。由于裂殖壺菌容易培養(yǎng),生長速度快,并且細(xì)胞內(nèi)的DHA含量高等優(yōu)點(diǎn),成為微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA的優(yōu)良菌種。本論文從裂殖壺菌培養(yǎng)基中氮源的優(yōu)化、聚酮合酶(PKS)基因的克隆以及轉(zhuǎn)化等方面進(jìn)行研究,為降低裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的成本,提高裂殖壺菌生物量、DHA含量奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)室前期成功實(shí)現(xiàn)了豆粕水解物做裂殖壺菌發(fā)酵中的氮源,替代了酵母提取物,降低了生產(chǎn)成本,但是豆粕水解液的制備需要酸解,易腐蝕設(shè)備,而且操作繁瑣。因此迫切要求尋找適宜的廉價(jià)氮源以滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求。本研究以裂殖壺菌Aurantiochytrium limacinum OUC168為實(shí)驗(yàn)菌株,首次以玉米漿干粉做氮源進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),結(jié)果裂殖壺菌在以酵母提取物(20g/L)做氮源的培養(yǎng)基上生物量為4.40 g/L·d, DHA含量是8.95%；在玉米漿干粉(20g/L)做氮源的培養(yǎng)基上生物量是4.13g/L·d, DHA含量是8.72%,由于玉米漿干粉的價(jià)格是酵母提取物的十分之一,在生物量和DHA含量差幅不大的情況下,大大降低了發(fā)酵生產(chǎn)的成本,對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)有重要意義。進(jìn)一步以玉米漿干粉、谷氨酸鈉、葡萄糖這三個(gè)因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),結(jié)果葡萄糖120g/L、玉米漿干粉15g/L、谷氨酸鈉20g/L得到了最高的生物量和DHA含量,分別為5.48g/L·d和12.50%,為以后的發(fā)酵生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)。聚酮合酶(PKS)是裂殖壺菌合成多不飽和脂肪酸的一個(gè)關(guān)鍵酶,本研究采用Genome walking方法,克隆得到了完整的pksl (4386bp)基因序列。并首次克隆得到了含有CAAT-box和TATA-box等啟動(dòng)子元件的pks1基因的啟動(dòng)子序列。為從分子水平研究和改造裂殖壺菌來提高DHA的合成奠定了基礎(chǔ)。將本研究中獲得的pks1序列與實(shí)驗(yàn)室前期獲得的pks2序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)在2991bp--4386bp處序列相似性很高,達(dá)78%,該序列經(jīng)BLAST比對(duì)屬于丙二酰轉(zhuǎn)移酶酶域,具有將丙二酸單酰-CoA裝載到酰基載體蛋白(ACP)的功能,該序列在兩段pks基因中都存在,推測(cè)其在DHA合成中具有重要作用,因此本研究將該序列構(gòu)建同源重組載體p18SCPGC-1,轉(zhuǎn)化裂殖壺菌,使其在裂殖壺菌中過量表達(dá)。通過對(duì)轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)、生長曲線、生物量及DHA含量的性狀分析,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化菌株生物量為5.02g/L·d,比未轉(zhuǎn)化菌株提高14.6%,轉(zhuǎn)化菌株的DHA含量是17.11%,比未轉(zhuǎn)化菌株提高37.90%。本文首次成功使用玉米漿干粉作為氮源來培養(yǎng)裂殖壺菌,為降低生產(chǎn)成本,提高裂殖壺菌的工業(yè)化生產(chǎn)水平提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)；對(duì)pks1基因的克隆分析及構(gòu)建酶域過表達(dá)菌株為研究DHA合成過程中相關(guān)酶的功能,并為基因工程方法制備高產(chǎn)DHA菌株奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q93;Q78

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 許永;臧曉南;徐滌;張學(xué)成;;裂殖壺菌誘變篩選的研究[J];中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2012年12期

2 陳嬌;周智;尹一兵;張雪梅;李銳;李月恒;王勤花;黃雅靜;;電轉(zhuǎn)化法構(gòu)建變形鏈球菌UA159 comD缺陷菌株[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2011年04期

3 馮云;任路靜;魏萍;仝倩倩;紀(jì)曉俊;黃和;;微生物發(fā)酵產(chǎn)二十二碳六烯酸代謝機(jī)理的研究進(jìn)展[J];生物工程學(xué)報(bào);2010年09期

4 郝小夏;;用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化巴氏畢赤酵母表達(dá)人核心蛋白聚糖[J];山西醫(yī)藥雜志;2010年05期

5 王娟飛;陳志森;陳軍;;三角褐指藻PPDK基因RNAi載體的構(gòu)建和基因槍轉(zhuǎn)化[J];廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2010年03期

6 高炳淼;唐天樂;長孫東亭;羅素蘭;;畢赤酵母高效電轉(zhuǎn)化條件的研究[J];中國海洋藥物;2010年02期

7 劉靜;高媛媛;江賢章;毛若雨;田寶玉;柯崇榕;吳松剛;黃建忠;;低溫脅迫對(duì)裂殖壺菌DHA生物合成及SOD表達(dá)的影響[J];藥物生物技術(shù);2010年01期

8 鄭苗苗;張旭;侯琨;王占斌;;真菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)研究進(jìn)展[J];農(nóng)業(yè)科技與裝備;2008年02期

9 宋曉金;張學(xué)成;朱路英;李荻爾;;用富含DHA的裂殖壺菌對(duì)輪蟲進(jìn)行營養(yǎng)強(qiáng)化的研究[J];海洋科學(xué);2007年12期

10 張永光;陳獻(xiàn)忠;饒志明;沈微;方慧英;諸葛健;;產(chǎn)甘油假絲酵母兩種轉(zhuǎn)化方法的比較[J];食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào);2007年03期

本文編號(hào)：2804410